葡萄附生菌群中致腐菌拮抗酵母的筛选及初步鉴定

程雅芳，杨梦昕，朱秋雨，覃兴熹，檀倩影

（广西卫生职业技术学院，广西南宁 530023）

葡萄是广西重要的经济型水果，2021 年广西壮族自治区葡萄的栽种面积已经超过313 km2，产值超84 亿元。用于鲜食葡萄的产量占到总产量的80%以上，鲜食葡萄本身含糖含水量就高，极易感染病原微生物造成果梗干硬而脱粒，果实腐烂变质，给果农造成超过20%的经济损失[1-2]。一年两熟的葡萄想要贮藏2 个月左右到春节前上市，贮藏保鲜的技术是目前关注的主要问题。虽然在贮藏和网络销售的过程中都应用了低温保藏技术，但仍有耐低温的病原菌繁殖影响葡萄的食用价值。经过研究发现，广西葡萄贮藏中的主要致病菌为导致灰霉病的灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）和导致白腐病的白腐垫壳孢（Coniella diplodiella）。在传统的保藏方法中常采用化学防腐的方法，加入化学防腐剂，如二氧化氯、硫化物[3]、二氧化硫[4]和1-甲基环丙烯[5]等化学保鲜剂。病原微生物容易对化学保鲜剂产生抗药性，同时也存在化学试剂残留、环境污染和果实品质下降等危害，对人身体健康造成潜在影响。酵母具有遗传背景清晰、自身安全水平高、无污染、对化学抑菌剂抗性强、对低温和贫养环境耐受性强、易在果蔬表面定植和适合生物保鲜等优点。研究者陆续对隐球酵母、汉逊德巴利酵母、红酵母等多种具有保鲜效果的酵母菌种进行了研究[6-7]，证明了酵母在水果保鲜中具有显著的抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

阳光玫瑰葡萄，采购于自广西武鸣东盟开发区基地，选用成熟度基本一致且无病虫害、无机械损伤的果实[5]，用无菌带密封，用微生物采样箱（0 ～4 ）带回实验室4 保藏。灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）和白腐垫壳孢（Coniella diplodiella），广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所；马铃薯葡萄糖肉汤培养基（Potato Dextrose Broth，PDB）、YPDA 霉菌酵母计数增菌培养琼脂，青岛海博生物技术有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA)培养基，北京陆桥生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。样品洗脱液的配制：0.9%氯化钠、0.1%蛋白胨、0.01%吐温80。

GI54DP 立式压力蒸汽灭菌器，厦门致微；BCC-1000IIA2 生物安全柜，上海申安医疗器械厂；E100 显微镜，南京江南永新光学有限公司；LRH-150-B 生化培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司。

1.2 拮抗酵母菌的筛选

1.2.1 样品的采集

选择广西武鸣东盟开发区基地3 种葡萄品种（阳光玫瑰、巨峰玫瑰、维多利亚）葡萄种植区，分别对果实、叶片、土壤随机取3 个样，然后进行密封包装，并标记时间、地点、种类[8]。

（1）梯度稀释法[9-10]。土壤取样除去葡萄根际表层3 ～4 cm 的浮土，取4 ～10 cm 处的土壤装于无菌取样袋中，风干后过筛，混匀后取15 g，溶于100 mL样品洗脱液中，加入玻璃珠在180 r·min-1的摇床上28 振荡90 min。将洗脱液用无菌生理盐水稀释3 个梯度10-1、10-2、10-3，分别吸取稀释液100 µL涂布到葡萄汁平板（1 ∶10 阳光玫瑰葡萄原汁），4 培养12 d，选取形态不同但类似酵母形态的单菌落，在YPDA 培养基上划线纯化，显微镜镜检后，留存类似酵母的真菌。

（2）表面提取法。选择3 个品种，每个品种的果实在不同区域采样，选取无病伤且果粉保持较好的果实15 个，放入三角瓶，样品提取液没过果实。将其放入28 摇床180 r·min-1振荡洗脱60 min。采用（1）同样方法做3 个稀释度，在葡萄汁平板4 培养12 d，YPDA 培养基纯化、镜检留存类似酵母的真菌。

1.2.2 致病真菌的纯化培养

对-80 低温保藏的灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）和白腐垫壳孢（Coniella diplodiella）进行活化，在100 mL 的PDB 培养液中28 培养72 h，涂布在PDA 平板，28 培养7 d，刮取适量孢子，放入含250 mL 无菌生理盐水的三角瓶中，加玻璃珠振荡摇匀、滤纸过滤，除去菌丝后得到孢子悬浮液，在4 冰箱保存、待用。使用时涂布到PDA 平板。

1.2.3 PDA 平板初筛及对峙法复筛

通过模拟葡萄贮藏条件，初步得到在低温、低营养的平皿上仍能繁殖的菌株，通过初步形态和显微镜观察为酵母菌的菌株，分别接种于含有灰葡萄孢霉和白腐垫壳孢的PDA 平板上，通过平板透明圈法选出具有抑制效果拮抗酵母12 株。采用对峙培养法对具有初步耐低温且有抑菌作用的12 株酵母菌进行复筛，观察并测定酵母菌株的拮抗系数。用YPD培养基28 培养拮抗酵母，用血球计数法测酵母菌浓度，取浓度为1.3×108CFU·mL-1的酵母菌悬液均匀地涂布在9 cm 的PDA 培养基上，中心放置直径为3 mm 的培养第5 d 的病原菌菌饼，每个酵母菌做3 个重复，无菌水处理作为对照[11]。28 恒温培养，每天观察菌丝扩展速度。第5 天测量病原菌的菌落直径。根据公式（1）分别计算对灰霉病致病菌和白腐病致病菌的抑菌率，筛选出对两种致病真菌均有拮抗作用的菌株1 株。

1.3 果实体内拮抗实验

选择新鲜饱满、无机械损伤和病虫害的阳光玫瑰果实作为实验材料，用75%酒精消毒，无菌水冲洗后风干[12]。每粒葡萄果实用灭菌后的接种针刺5 个孔（2 mm 深），将针刺过的葡萄放入1.3×108CFU·mL-1的酵母菌悬液浸泡1 min 后取出风干，再将果粒浸泡到灰葡萄孢霉的孢子悬液中1 min，捞出风干。同样处理方式，用无菌果实，先针刺再浸泡于1.3×108CFU·mL-1酵母菌悬液1 min，再将果实泡在白腐垫壳孢的孢子悬浊液中1 min，捞出自然风干[12]。模拟售卖葡萄的两种贮藏条件做果实体内实验：①在4 冷藏20 d 后25 贮藏5 d，计算葡萄的腐烂率（果粒表面病原菌导致出现斑块时即认定为腐烂）；②在室温（25 ）贮藏15 d 后计算葡萄的腐烂率。两种贮藏方式同时做空白对照（未浸泡拮抗酵母）。每个实验设3 个重复，每次实验重复2 次[13]。根据公式（2）计算葡萄果实的腐败率。

1.4 拮抗酵母菌的鉴定

对筛选出拮抗效果最明显的菌株进行形态学鉴定，将其菌株接种于PDA 平板上，在28 条件下培养5 d，观察菌落形态。同时进行碳源同化、糖发酵实验。采用26S rDNA 序列分析法，对拮抗效果明显的酵母菌进行分子生物学鉴定，采用D1/D2 区域通用引物进行PCR 扩增，扩增后的产物进行测序，利用MEGA5.05 构建系统选择相似度最高的酵母菌株序列建立系统发育进化树鉴别[8]。

2 结果与分析

2.1 拮抗酵母菌的分离纯化结果

葡萄一般贮藏在4 下，且葡萄表面营养物质并不丰富，因此选用低温、低养分条件，用稀释葡萄汁为培养基筛选拮抗酵母菌，筛选出在此条件下，仍能生长良好的酵母菌32 株，其中根系土壤样本收集到拮抗酵母菌21 株，果实样本收集到拮抗酵母菌8 株，叶片样本收集到拮抗酵母菌3 株。

2.2 拮抗酵母筛选结果

PDA 平板对峙实验结果显示，从武鸣果园采集的样本中分离出的32 株酵母菌，其中W1-8、W2-19、H1-5、H2-23、Y3-1、Z2-12、Z2-3 对引起葡萄灰霉病的灰葡萄孢霉拮抗效果较好；W2-3、H1-11、H2-3、Y3-7、Y1-18、Z2-12 对引起葡萄白腐病的白腐垫壳孢拮抗效果较好（表1）。其中在32 个酵母菌株中只有代号Z2-12 对灰葡萄孢霉和白腐垫壳孢都具有明显的拮抗效果（图1）。对于病原菌具有较好抑制效果的菌株，分别将其用于后续的活体防病实验。

图1 Z2-12 对葡萄灰霉病菌和白腐病菌的对峙实验

表1 不同初筛酵母对两种病原真菌的抑菌率

2.3 果实体内实验结果

从图2 中可以看出，Z2-12 对两种真菌引起的阳光玫瑰葡萄腐烂抑制效果明显。使用Z2-12 酵母悬液处理葡萄果实，在第一种贮藏条件下（4 冷藏20 d、25 贮藏5 d），对照组白腐病腐烂率为54.2%，拮抗组为12.1%；在第二种贮藏条件下（室温25 贮藏15 d）对照组白腐病的腐烂率为72.4%，拮抗组的腐烂率为28.9%，两种条件下，拮抗组的腐烂率均明显低于对照组。同样的方法，在第一种贮藏条件下，对照组灰霉病腐烂率57.3%，拮抗组为19.7%；在第二种贮藏条件下，对照组灰霉病腐烂率为80.2%，拮抗组为30.7%，同样说明两种条件下拮抗组的灰霉病腐烂率明显低于对照组。

图2 Z2-12 对致病真菌导致的腐烂的控制效果

2.4 拮抗菌株Z2-12 的鉴定

如图3 所示，拮抗酵母Z2-12 的菌落形态为中间隆起的圆形、乳白色且不透明，无色素，表面光滑湿润无褶皱，边缘完整光滑。菌体在光学显微镜下成椭圆透明状，在液体培养基中沉淀生长且产气。从表2 可以看出，待测酵母Z2-12 对葡萄糖、蔗糖、海藻糖等能进行发酵且可以进行同化，对乳糖、麦芽糖、淀粉不能进行发酵和同化。经26S rDNA 序列分析鉴定，该菌与GenBank 中为Saccharomyces cerevisiaeAY939814.1（酿酒酵母）相似性达99%。初步判断Z2-12 菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

图3 Z2-12 菌落形态

表2 Z2-12 菌株对相关糖的利用情况

3 结论

在植物生长的环境中，存在丰富的生防微生物。寻找在低温、限制营养的条件下同样能起到生防效果的微生物，对葡萄贮藏保鲜的实际应用价值更大。本文利用1 ∶10 葡萄汁培养基，在4 下筛选出生长状态良好Z2-12 菌株，在PDA 培养基上显示出对灰葡萄孢霉和白腐垫壳孢都具有良好的拮抗效果，对这两种致病菌的抑制率分别是53.07%和68.28%。同时用在阳光玫瑰表面做果实体内测试，结果表明在两种贮藏条件下，Z2-12 酵母悬液处理过的果实都表现出明显的拮抗效果，白腐病的腐烂率比对照组的分别减少了42.1%和43.5%；灰霉病的腐烂率比对照组的分别减少了37.6%和49.5%。在两种贮藏条件下，Z2-12 对两种腐烂病都有明显的抑制效果。结合拮抗菌株Z2-12 的形态学、生物化学和分子生物学检测结果，判断该菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。此菌株在低温贮藏和常温销售的过程中都可以表现良好保鲜效果，此菌株的拮抗机理有待进一步的研究。在后续的研究中可分析Z2-12 菌株酵母发酵液的浓度、pH 值等发酵条件对保鲜作用的影响，进一步结合物理保鲜方法，提高阳光玫瑰葡萄的储藏期和货架期，可以实现鲜食葡萄的产期调节和一年两收葡萄在中国主要节庆消费高峰时段的鲜果供应，提高果农经济收益。