MAX 固相萃取-UPLC-MS/MS 法测定肉类及其制品中L-谷氨酸钠含量的方法

李 琳，张作栋，王 丹

（1.潍坊市疾病预防控制中心，山东潍坊 261061；2.潍坊市人民医院，山东潍坊 261000）

谷氨酸钠（C5H8NNaO4）是一种由钠离子与谷氨酸根离子形成的盐[1]。常见的谷氨酸钠，即日常用作味精等调味品的主要成分是L-谷氨酸钠[2]。现行标准规定谷氨酸钠的测定方法是高氯酸非水溶液滴定法、旋光法、酸度计法，缺乏总膳食中各种食品复杂基质样品中L-谷氨酸钠提取、测定的方法研究[3-4]。

本文拟建立MAX 固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱法检测肉类及其制品中L-谷氨酸钠的含量。通过实验分析比较，寻求灵敏度高、准确度好、易于操作的样品前处理条件和超高效液相色谱/串联三重四极杆质谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲 醇（ 色 谱 纯，Fisher）； 乙 腈（ 色 谱 纯，Fisher）；氯化钠（优级纯，国药集团）；甲酸（色谱纯，Thermo）；盐酸（优级纯，Scharlau）；氢氧化钠（优级纯，国药集团）；氨水（色谱纯，Fisher）；屈臣氏蒸馏水。

固相萃取柱：MAX 混合型强阴离子交换反相固相萃取柱（Waters Oasis，3 cc/60 mg/30 µm）。标准品：L-谷氨酸钠[C5H8NO4Na，CAS：142-47-2，≥99%（HPLC），Merk]。

1.2 仪器

超高效液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪（UPLC-MS/MS，Aglient1290-6460）； 高 速 冷 冻离心机（LYNX400，Thermo）；氮吹仪（NEVAP，Organomation）；涡旋振荡器（Heidolph）；电子天平（ARA520，奥豪斯上海有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱2.1 mm×100 mm，2.7 µm，Agilent poroshell 120 PFP 柱；流动相A 相0.2%甲酸水溶液、B 相0.2%甲酸的乙腈；梯度洗脱；流速0.2 mL·min-1；进样体积10 µL；柱温40 等。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子模式；毛细管电压4.0 kV；喷嘴电压0.5 kV；气体流量3.0 L·min-1；气体温度300 ；喷雾器电压40 psi；鞘气流量10 L·min-1；鞘气温度300 。多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）扫描模式；L-谷氨酸钠定性定量离子对147.90/84.10、147.90/56.05，碰撞能量16 eV、23 eV。

1.3.3 样品提取与净化

准确称取0.5 g 均匀均质后样品于10 mL 离心管中，加入1.0 g NaCl，加入5 mL 0.1 mol·L-1HCl 萃取，涡旋2 min，超声20 min，高速低温离心10 000 r·min-15 min，取1 mL 上清液待净化。以1 mL 5% NH3·H2O 活化MAX 柱，抽干，1 mL 上述上清液与1 mL 0.1 mol·L-1NaOH 中和后，以2 mL 中和液上样，0.5 mL 纯水淋洗2 次，0.5 mL 甲醇淋洗2 次后，以0.5 mL 含2%甲酸（v/v）的甲醇溶液洗脱2 次后，洗脱液合并，氮吹吹干并以0.1 mol·L-1HCl 复溶，以流动相初始比例（0.2%甲酸水溶液∶0.2%甲酸的乙腈=60 ∶40）稀释样品100 倍，经0.22 µm 滤膜过滤后上机测定。

2 结果与分析

2.1 预处理条件选择

肉类及其制品种类繁多，基质复杂，在前处理方法上要求较高[5]。本方法以纯水、盐酸水溶液、初始比例流动相作为提取液[6]，通过1.3.3 的实验过程，发现盐酸水溶液提取回收率较高，重复性好，满足样本测定要求，最终确定0.1 mol·L-1HCl 为样品提取液。提取液中除谷氨酸钠外还含有大量其他物质，因此提取和净化方面选择吸附力较强MAX 固相萃取柱。

2.2 色谱条件的选择

Agilent poroshell 120 PFP 柱（2.1 mm×100 mm，2.7 µm）由表面多孔填料组成，该填料含有实心内核和多孔外层，这种填料在低压下柱效高，是快速高分离度分离多种类型分析物的理想选择。用于本方法峰形尖细对称，对目标峰干扰小（图1）。

图1 谷氨酸钠总离子流图

2.3 质谱条件的选择

根据待测物质带正电荷的性质，以1 mg·L-1的标准溶液在ESI 正离子模式下进行扫描，确定母离子、子离子，优化碰撞能量，优化MRM 模式下各部分温度、电压、流量等条件，见1.3.2。MRM 特征离子谱图见图2。

图2 MRM 特征离子谱图

2.4 方法的标准曲线及线性范围、检出限

为提高检测的灵敏度，采用147.90/84.10 离子定量，147.90/56.05 离子定性。配制多个浓度水平标准溶液，最终确定线性范围在0.01 ～1.00 mg·L-1。以其峰面积（Y）对其浓度（X）作线性回归分析，回归方程为Y=4 231X+680，R2=0.995 5，R=0.997 7。以产生3 倍信噪比（S/N）时的浓度为检出限（LOD），LOD为15 mg·kg-1；以产生10 倍信噪比（S/N）时浓度为定量限（LOQ），LOQ 为50 mg·kg-1。

2.5 方法的精密度与回收率

称取1.0 g 空白样品，加入0.10 mg 谷氨酸钠标准品，放置1 h 后，按照1.3.3 方法提取净化上机测定，平行测定6次，计算加标回收率与相对标准偏差（RSD）（表1）。实验结果表明，该方法的平均加标回收率为89.04%，相对标准偏差(n=6）为2.28%，符合分析的要求。

表1 谷氨酸钠回收率和相对标准偏差

2.6 样品测定

用本方法对本地区65 份肉类及其制品进行检测，检出含有谷氨酸钠样品42 份，检出率64.62%。其中生肉制品22 份，检出1 份，检出率4.55%，检出样品集中在加入腌料的生肉制品中；加工熟肉制品43份，检出41 份，检出率95.35%，与实际情况相符。

3 结论

本方法建立了MAX 固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱法，用于检测肉类及其制品中L-谷氨酸钠的含量。该方法具有操作技术简便、快捷、灵敏的特点，同时具有较好的准确度和精密度，可满足肉类及其制品中谷氨酸钠含量的测定。