酿造用米曲霉菌种选育的研究进展

范梦雪，王璐瑶，陈卫卫，王新杰，王友升，程仕伟,*

（1.鲁东大学生命科学学院，烟台市生物发酵与分离工程实验室，山东 烟台 264025；2.山东食圣酿造食品有限公司，山东 烟台 261411；3.北京工商大学轻工科学技术学院，北京 100048）

米曲霉作为丝状真菌中的一个常见种，属曲霉属，分布范围广泛，主要分布于发酵食品、粮食、土壤和富含丰富有机物的腐败物中。不同于黄曲霉，米曲霉不会分泌致癌的黄曲霉毒素，是世界卫生组织和美国官方认证的食品级公认安全（generally recognized as safe，GRAS）菌株[1]；其具有生长条件宽松、繁殖能力旺盛、抗逆性强、产孢量大、酶系丰富等特点，广泛应用于食品行业。米曲霉在食品发酵应用中具有一千多年的历史[2]，是我国食品酿造的重要菌种。米曲霉分泌蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、脂肪酶等，与其他微生物分泌的酶系共同作用[3]，可将原料底物分解，经过复杂的生化反应，最终使发酵终产物具有特殊的颜色、香味、口感和状态[4-5]。此外，米曲霉的代谢产物也被广泛应用于医药、化妆品、农业等领域[6-7]。

米曲霉无法进行有性杂交育种[8]，且形成多核分生孢子，使得经典的遗传操作难以实施[9]。米曲霉保藏过程中容易发生菌种的退化，导致酶活性及代谢机能衰退，最终影响终端产品的质量和生产效率。为了进一步提高其酶类及其他代谢物的产率，确保发酵过程中产品质量的稳定，满足不同的生产需求，国内外开展了对米曲霉菌株的改造。米曲霉分泌机理的深入研究和分子生物学技术的发展促进了米曲霉在现代生物领域中的应用。国内外育种工作者通过不同的方法定向改良菌株以扩大菌种资源，取得了显著的成效。本文主要归纳分析国内外提高米曲霉产酶量或代谢物活力的自然选育、诱变育种和基因工程等育种方法的研究进展，以期为研究同行拓展思路，并为米曲霉菌种的生产应用提供参考依据。

1 自然选育

早期酿造行业所用的菌株均来源于野生环境中，通过自然接种的方式进行制曲。自然选育无法保证米曲霉菌株产蛋白酶活力维持在较高的水平，同时也容易被其他杂菌污染，导致产品质量降低。因此，微生物纯培养即自然选育逐渐取代自然培养，通过划线培养、稀释涂布、透明圈法等，分离野生环境中分泌蛋白酶能力较强、抗杂菌、环境耐受力强的米曲霉。通过进一步改进培养条件，既能够尽可能地减少发酵过程中其他杂菌的掺入，提高曲的质量，同时也可以有效地缩短制曲的时间，保证发酵产物的风味和品质，自然选育作为一种经典的育种方式被沿用至今。

林祖申[10]从福建永春酱油曲中筛选出了产酶性能优良的米曲霉中科AS3.863，其蛋白酶活力达到95.1 U/g。El-Korany等[11]在采集的土壤样本中分离出了胰脂肪酶有效抑制剂产生菌——米曲霉AspsarO，该菌株代谢产物的胰脂肪酶抑制率与奥利司他的胰脂肪酶抑制率（（41.00± 2.45）%） 没有显著差异，经生产条件的顺序优化，米曲霉AspsarO胰脂肪酶的抑制率最高可以达到61.4%，且对高脂饮食（high-fat diet，HFD）实验鼠的食欲有明显的抑制效果，减缓了其体质量增加速率。Ao Xiaolin等[12]在发酵的蚕豆中分离出了一株中性蛋白酶高产菌株Y1，中性蛋白酶经纯化后比活力（2 264.3 U/mg）提高了10 倍，该中性蛋白酶具有良好的耐高温性和广泛的酸碱性，在工业上具有良好应用前景。Mamo等[13]从埃塞俄比亚土壤样品中分离筛选出可分泌凝乳蛋白酶的米曲酶DRDFS13，经过优化后的培养基培养后，凝乳活力从优化前的77.74 U/mL提高到168.47 U/mL。

虽然自然选育优良菌株的方法非常经典，但随着科技的进步，这种育种方式凸显出一些弊端，如菌株在自然环境下发生自发突变的几率较低；突变方向具有不确定性和多害少利性，难以控制菌株的性状；育种周期较长，工作量大。因此，需要结合人工诱变的技术来改变菌种的遗传信息，从而改变其结构或功能以达到菌种改造的目的。

随着科技的发展，通过筛选自发产生正向突变的菌株已经无法满足工业上的需求。操作更方便、更高效的菌种选育方法，如物理诱变、化学诱变、原生质体融合和复合诱变等多种诱变育种技术逐步被用于微生物菌株的性能改造。

2 物理诱变

2.1 紫外诱变

紫外诱变技术具有操作简单、诱变快速、效率高、无二次污染、诱变随机性较强等特点[14]，被广泛用于育种工作中。生物内部的遗传物质具有很强的紫外吸收能力，且在紫外波长为260 nm处失活率达到最大[15]。经过紫外线辐照后，会破坏DNA分子正常的配对方式而形成阻碍碱基配对的嘧啶二聚体，增加了微生物发生突变或死亡的几率。另外，形成的嘧啶二聚体会使RNA引物的合成和DNA合成受阻，进而影响其正常的转录和复制[16]。

1976年，上海市粮油工业公司通过紫外诱变米曲霉AS3.863并配合高蛋白驯养技术，获得比原菌种蛋白酶活力提高了33%的米曲霉沪酿3.042，该菌株具有产孢量大、繁殖快、抗逆性强、易培养、酶活旺盛等特点[17]。其蛋白酶活力达到142.6 U/g，不仅缩短了制曲时间，同时提高了酱油出品率。随后，米曲霉沪酿3.042菌株在全国得到了推广和应用。此后，许多育种工作者以米曲霉沪酿3.042作为出发菌株进行改造，以期获得特定性状的新菌株。Murthy等[18]对米曲霉RIB40进行紫外诱变，获得突变株F6，其分泌的酸性蛋白酶活力是出发菌株的5.6 倍。李鹏等[19]对菌株CICC2066进行多次紫外诱变，筛选所得的菌株UY-20发酵后氨肽酶活力是出发菌株的1.54 倍，且中性蛋白酶活力由初始的830.8 U/g提高到890.2 U/g。

紫外诱变虽然具有方便、快捷、低成本等诸多优点，但频繁使用容易导致菌株对紫外诱变产生一定的耐受性，若继续仅通过紫外诱变则难以实现菌株成功选育。另外，从宏观上看，现有的辐射诱变技术手段下，很难获得新的突破性变异性状[8]，这就要求增加诱变育种方式的多样性，提高通过诱变获得优良性状菌株的几率。

2.2 等离子体诱变

常压室温等离子体（atmospheric room temperature plasma，ARTP）是一种新兴的诱变技术，在正常大气压下产生高活性粒子的等离子射流，改变微生物细胞膜和细胞壁的结构和通透性，并能够引起DNA损伤[21]。研究表明，通过射频电源并使用氦气产生的ARTP，可使质粒DNA和寡核苷酸发生不同程度的断裂。在对活菌细胞诱变中，ARTP诱变比紫外诱变和化学诱变呈现出更高的突变率[22]，这使得ARTP突变育种在优化微生物性状方面具有极大潜力。ARTP使用低电压射频电源，具有操作简单和安全性高等特点，越来越受到微生物育种研究人员的青睐。

童星等[23]对米曲霉As3.951进行ARTP诱变，突变株ZA189的中性蛋白酶活力由2 568 U/g提高到3 210 U/g，此外，淀粉酶和谷氨酰胺酶活力均有不同程度的提高。Shu Liang等[24]利用ARTP诱变系统对米曲霉沪酿3.042菌株进行诱变，获得可稳定遗传的突变菌株B-2，与出发菌株相比，其酸性蛋白酶（117.9 U/g）和中性蛋白酶（407.5 U/g）活力分别提高了54.7%和17.3%。Gao Xianli等[25]采用ARTP技术对米曲霉沪酿3.042诱变，突变株H8的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和天冬氨酸氨基肽酶活力相较于原始菌株均显著增加，耐盐碱性蛋白基因和天冬氨酸氨基肽酶基因表达量分别提高了约30%和27%。樊嘉训等[26]对米曲霉沪酿3.042进行了4 轮ARTP诱变，菌株H34的蛋白酶活力提高145.6%。最近研究表明，采用氮气微介质阻挡放电等离子体处理米曲霉KACC47488菌株的孢子可以促进孢子的萌发并激活mpkA（一种丝裂原活化蛋白激酶）激酶，增强了相关基因的转录[27]，通过这种方式可以缩短制曲时间，进而提高发酵速率。

ARTP具有高突变、操作安全、无污染等优点，但该技术需要专门的仪器设备，这限制了它的大规模使用。同时，此项技术无法控制突变的方向和性质，因而ARTP诱变育种技术仍有进一步完善的空间。在今后的研究中，应实现量化ARTP剂量[28]，进一步提高其诱发突变的可控性，更好地优化和推广该技术的应用。

2.3 离子注入诱变

离子注入诱变是将离子进行高能加速处理后注入微生物胞内的诱变方法，注入的离子能与微生物发生物理、化学作用，直接或间接地使微生物胞内的遗传物质发生突变[29]，进而可筛选获得目标菌株。Zhao Guozhong等[30]利用氮离子注入诱变米曲霉3.042获得突变株A100-8，其酸性蛋白酶活力达到2 834.6 U/g，提高了44.1%。凌帅等[31]对紫外诱变后获得的菌株UV7再进行氮离子注入诱变，筛选得到米曲霉N11，其曲酸产量提高了30.38%。杜冰冰[32]采用氮离子注入诱变处理米曲霉沪酿3.042，获得发酵性能良好的菌株A100-4，其纤维素酶和蛋白酶活力分别较初始菌提高了40%和30%。

虽然离子注入诱变具有较高的诱变几率，但离子注入设备复杂且价格昂贵[33]，同时所需要的真空环境会导致微生物大量失水，此外，诱变过程的高温使细胞大量死亡[34]，这些均限制了此项技术的应用。

2.4 γ射线诱变

γ射线是一种比X射线频率更高的电磁波，更具穿透力[35]，破坏性小于快中子[36]，产生的高能电离作用力可间接产生自由基，引发基因突变和染色体畸变，改变遗传性状，尤其适合诱变产孢子的真菌[37]。解西玉等[38]对米曲霉采用60Co-γ射线进行诱变，当射线剂量达到800 Gy时效果最佳，获得的突变株C8-128的曲酸产量是出发菌株的3.9 倍。研究人员将米曲霉HAk2暴露于不同剂量的γ辐射进行诱变，其中米曲霉HAk2-M26是最稳定的突变体，其曲酸产量比野生型菌株HAk2高2.03 倍[39]。Aleem等[40]通过高电离诱变剂γ射线来诱导改造菌株RIB40，得到了超级突变体M-100（6），该突变体不仅对Triton X-100和分解代谢物阻遏具有抗性，α-淀粉酶产量提高了约12 倍，而且该酶在55 ℃下不可逆热稳定性提高了2.5 倍，在食品和饲料工业中有巨大的应用潜力。

γ射线诱变虽简便快捷，但存在一定局限，有一定危险性；此外，辐射过程受诱变时间、诱变剂量、生物种类和环境条件等多因素影响[41]，难以控制诱变的方向和性质，导致诱变率低、致死率高、有益突变少，甚至会出现无效辐射或存活率极低的情况。因此，需要完善对相关机理和技术的研究，提高正向突变率。

2.5 微波诱变

微波是一种有高频性和波动性的低能电磁波，对生物具有热效应和非热效应。微波产生的振动能够穿透至胞内，进一步对疏水键、氢键及范德华力产生影响，并使基因结构改变，发生遗传变异。管海华等[42]对米曲霉ZQV16进行60 s的微波诱变，筛选后得突变株ZQH48，其纤维素酶活力是出发菌株的1.5 倍。高紫君等[43]对菌株UV15进行微波诱变，筛选后得到的突变株M22曲酸产量达到34.28 g/L，比出发菌株提高了19.2%。

微波诱变因设备简单、操作方便、易变异、安全性高等特点[44]而广泛用于农业、工业的育种工作，但该诱变方法的非热效应作用机制尚不明确，且诱变具有不定向性，筛选诱变株工作量大。此外，实验室诱变多采用普通微波炉，功率无法实现连续可调，无法按需调节频率和功率，且不能直接消除产生的热效应，大功率的辐照会使诱变体系迅速升温，蛋白变性失活，菌种因较强的热效应而死亡，无法筛选出微波诱变导致的基因突变[45]，因此，需要严格把控辐照的时间和温度。

2.6 激光诱变

激光诱变作为辐射微束技术中的一种新型诱变剂，集电、光、热、磁场和电压的综合效应于一体，作用于微生物的DNA分子时，可造成核酸链的断裂和损伤，改变遗传物质结构，从而通过诱变作用快速改良微生物[46]。葛菁萍等[47]对米曲霉HDF-C14进行He-Ne激光诱变，通过透明圈初筛选育出了突变株HDF-C14-H8，蛋白酶产生的透明圈直径增加了16.67%，为下一步的亚硝基胍诱变提供了出发菌株。总体来说，激光诱变所得的变异类型较为丰富，且遗传稳定性较高，但成本也较高。

2.7 超高压诱变

超高压是指大于100 MPa的气压，随着技术的进步，超高压被广泛用于食品行业的除菌工作[48]。研究证明，高压可改变细胞体积，影响蛋白表达，改变DNA结构[49]，因此，（超）高压诱变成为一种新型的微生物诱变育种方法。王华等[50]通过高压诱变处理米曲霉3.042，发现其蛋白酶活力在压力为0～200 MPa范围内持续下降，但是随着压力进一步升高，在200～400 MPa范围内蛋白酶活力又逐渐增大，压力为400 MPa时酶活力达到最大值（2 142 U/g），理想的诱变株HP300a发酵后产生的成曲蛋白酶活力是原始菌株米曲霉3.042的1.43 倍。高压、超高压诱变开拓了微生物育种思路，可减轻因长期单一或反复诱变带来的菌株退化问题，但具体的诱变机理尚不明晰。

3 化学诱变

化学诱变育种是采用化学试剂处理微生物，诱导遗传变异，改变菌体性状，根据诱变目标筛选突变菌株。不同的化学诱变剂的作用机理不同，根据其作用方式主要分为3 类：1）DNA类似物，如8-氮鸟嘌呤、5-嗅尿嘧啶等碱基类似物，其一旦参与遗传物质的合成，就会代替正常的核苷酸配对，引起DNA结构变异、转录紊乱，进而引发菌株性状的改变；2）烷化剂和亚硝基类物质，如硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）、甲基磺酸甲酯（methyl methanesulfonate，MMS）、甲基磺酸乙酯（ethyl methylsulfone，EMS）等，使DNA的碱基发生错配和改变；3）其他类物质，如小分子嵌入型的诱变剂溴化乙锭（ethidium bromide，EB）、吖啶类及其衍生物，此类物质能够镶嵌入DNA的相邻碱基之间，造成移码突变[51]。

已有报道的米曲霉的化学诱变处理，多使用第二类化学诱变剂。袁艳玲等[52]对紫外诱变获得的菌株H12进行DES诱变，得到中性蛋白酶高产菌株H12-5，蛋白酶活力由1 438 U/g提高至2 158 U/g，诱变效果显著，为工业生产提供了性状优良的菌株。卢燕云[53]对紫外诱变后筛选出的突变株UV-5进行DES诱变，筛选出蛋白酶活力高达601.7 U/g的突变株D-7，比出发菌株提高了49.76%。朱运平等[54]对米曲霉11250进行40 min的亚硝酸钠诱变，其中突变株N4的柚苷酶活力最高可达168 U/mL，与出发菌株相比提高了166%。

化学诱变的形式多种多样，但单一化学诱变剂诱变米曲霉的研究较少，多采用与其他诱变方法共同组合的方式[55]。化学诱变简单易行，具有一定特异性。但化学诱变剂大多是有毒或致癌物质，安全性低，容易对人体产生危害，并且有益突变频率低。因此，通常对米曲霉不单独进行化学诱变，结合其他诱变方式进行复合诱变效果更佳。

4 原生质体融合

20世纪60年代，以遗传学、分子生物学等学科为基础并借助先进的实验技术，原生质体融合技术应运而生。融合已知性状供、受体菌的原生质体[56-57]，使得含所需表型的亲本菌株进行重组[58]，遗传传递更完整，效率更高[59]，可突破种甚至属的限制，不受以往亲缘关系的限制，加速微生物菌株的定向进化，进而获得具有理想表型的工业菌株[60]，应用领域广泛。

唐洁[61]利用原生质体的电融合技术，将长势快、蛋白酶活性低的米曲霉AS3.951和蛋白酶活性高、长势慢的米曲霉CICC2339进行遗传改造，并将制备好的原生质体灭活后进行电融合。经过筛选，融合菌株EF113的产酶活力最高，超越了原始菌株CICC2339，达到7 680 U/g。Xu Defeng等[62]将米曲霉与黑曲霉进行基因组重组，成功地选育出了酸性蛋白酶产量有显著提高的融合子，其中融合子F76产酸性蛋白酶活力接近1 500 U/g，比亲本米曲霉菌株高82.19%，培养条件优化后酶活力提高至1 936 U/g。Wang Shenghai等[63]将米曲霉SBB201进行紫外线（ultraviolet，UV）/LiCl诱变后的两个突变体UV-11和UV-76进行原生质体融合，经过3 轮的基因组重组得到融合突变体RIII-7，其果糖基转移酶活力达到了180 U/g，约为原始菌株的2 倍，且遗传稳定性较高；经发酵条件改进后，酶活力达到353 U/g，是原始菌株的3.4 倍。

原生质体融合技术是改良真菌遗传变异的有力工具，是一种具有巨大潜力的表型快速改良技术，在工业上受到极大关注[64]。同时，利用融合技术选育的菌种，可以普遍消除菌体在经过诱变处理后出现的产量提升缓慢问题。随着技术的革新，原生质体融合技术也解决了越来越多的杂交障碍。

5 复合诱变

菌株受到同一种诱变剂反复诱变时，会表现出抗性饱和现象[65]。例如，米曲霉沪酿3.042是野生型菌株经过多次紫外诱变获得的，当诱变强度达到一定程度时，继续提高菌株产酸性蛋白酶的活性变得更加困难。这可能是沪酿3.042菌株的诱变抗性饱和所致[66]。采用单一的诱变剂诱发的突变位点较为固定，往往达不到期待的诱变效果，因此，增加诱变剂的种类，更易获得正向突变，提高诱变成功的几率。

邵伟等[67]以米曲霉沪酿3.042为出发菌株，对其进行紫外-化学复合诱变后，经过筛选后得到一株蛋白酶活力很高的突变株A11，蛋白酶活力由3 447 U/g提高至3 668U/g，提高了6.41%。也有研究者对沪酿3.042的分生孢子先进行紫外-LiCl、亚硝基胍复合诱变，将所得的突变株再进行由聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介导的原生质体融合，最终得到中性蛋白酶高产菌株，其中FII-41分泌的中性蛋白酶活力达7 412 U/g，比原始菌株提高1.76 倍[68]。米曲霉CS3.03经UV-DES进行复合诱变处理后，获得遗传性状稳定的突变株P7，其蛋白酶的干基酶活力为4 994.18 U/g，比出发菌株增加了173.92%，有效提高了酱油酿造的氨态氮含量和全氮利用率[69]。于江[70]对米曲霉AS3.042进行UV-亚硝基胍复合诱变，诱变菌株ASQ-1的琥珀酸产量为初始菌的294 倍，进一步提高了酱油品质。

通过多项实验研究证实，多种诱变方式协同作用于原始菌株，基因突变位点增加，可显著提高微生物发生正向变异的概率，降低筛选工作量，缩短诱变周期，是微生物高效诱变育种中不可或缺的方法。

6 基因工程育种

2005年，日本联合多家机构对日本米曲霉RIB40的基因进行了测序[71]，这是第一株完成全基因组测序的米曲霉，标志着米曲霉全基因组时代的降临。基因工程技术的发展进一步推动了米曲霉优良菌株的选育，在米曲霉功能基因表达中具有水解活性的酶种类最多，其次是氧化还原酶和转运相关的酶，这也印证了米曲霉适用于食品发酵行业的原因。虽然大部分编码基因的功能还未被证实，但根据已经被解析的信息可以看出，参与水解酶、氧化酶相关的转录、翻译等生理活动极为活跃。基因工程为菌株性能改造提供了新思路。

6.1 转录因子调控

简单地分析菌体代谢物中的酶系表达情况，并不能完全反映菌体的生理活动，因其酶系的表达还受到相关转录因子的调控，要根据其宏观上的表达差异追溯到微观层面的变化。Tanaka等[72]发现，与野生菌株相比，缺失转录因子FlbC的米曲霉在固体培养中酸性蛋白酶和糖化酶的产量显著降低，而中性和碱性蛋白酶的产量则没有明显变化。这一结果表明，FlbC在固态培养中只参与酸性蛋白酶和糖化酶的合成，但不影响中性和碱性蛋白酶的合成。固态培养条件下，对FlbC介导的基因表达调控机制的深入探究，有利于进一步提高米曲霉固态发酵生产的效率。

PrtR是一种编码调节细胞外蛋白水解基因的转录因子基因，Mizutani等[73]使用构巢曲霉基因作为选择标记物替换米曲霉的PrtR基因，发现该转录因子的缺失导致细胞外蛋白酶活力显著降低。可以得出，PrtR对调节菌体胞外蛋白酶的分泌不可或缺，可尝试通过给PrtR转录因子更换不同类型的强启动子，以探究能否进一步提高胞外蛋白酶活力。Takahashi等[74]将原生质体细胞2号染色体（2号染色体上包含蛋白酶转录激活因子prtT及编码碱性蛋白酶和α-淀粉酶的基因）上的部分区域以断裂诱导复制方式易位到其他染色体上，得到含有2号染色体目标区域的二倍体或三倍体菌株，对过表达菌株进行基因表达及表型分析，结果发现，在二倍体菌株中蛋白酶和淀粉酶活力均有显著提高，在三倍体菌株中进一步增加；在过度表达蛋白酶的转录激活因子prtT后，二倍体和三倍体菌株的蛋白酶活性进一步增强。这表明在一定范围内适当增加结构基因和调控基因的拷贝数可增强由此产生的表型。这些结果表明，PrtR/PrtT是调节胞外蛋白水解基因表达的关键作用因子。虽然蛋白质水解基因的表达是受蛋白质、多肽诱导，但是直接活化PrtR/PrtT的作用底物尚不明确[75]，有待进一步研究，若解析出直接底物则可能进一步提高胞外蛋白酶的分泌。

Hunter等[76]从米曲霉RIB40中删除了creB基因，通过表型分析发现，一些水解酶活性有提高。在诱导物存在条件下，ΔcreB菌株的淀粉酶活力是原始菌株的2 倍多，纤维素酶和木聚糖酶活力较原始菌株分别提高50%和100%。Ichinose等[77]通过构建creA和creB双缺失突变株，发现双缺失后的ΔcreAΔcreB突变体木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活力比野生型菌株均高出100 倍以上，在固态培养中双缺失突变体的β-葡萄糖苷酶活力比野生型菌株高7 倍以上，这些结果表明，creA和creB基因的缺失可有效提高米曲霉的水解酶产生水平。

综上可以看出，调控酶基因的转录因子起着十分重要的作用，对于激活型转录因子可尝试增加拷贝数或更换启动子等方式来促进转录活动；同理，对于抑制型转录因子可考虑通过敲除、敲减等方式消除或减弱目标蛋白转录路径的影响。转录因子的调控，或为促进胞外蛋白酶分泌的研究拓宽思路。

6.2 编码基因异源表达

将米曲霉中编辑蛋白的基因在其他分泌能力更强的菌种中进行异源表达，分离纯化得到最终的目标蛋白，可实现高表达特定酶的批量生产。如将酸性蛋白酶克隆到毕赤酵母中，在培养的上清液中检测出酶活力达到50.62 U/mL[78]，为米曲酶酸性蛋白酶的异源表达提供了指导。

Kang Chao等[79]克隆了米曲霉中脯氨酰内肽酶（Aspergillus oryzaeprolyl endopeptidase，AO-PEP）基因并在毕赤酵母中表达，经分批高密度发酵，AO-PEP活力达到1 130 U/L；在啤酒酿造的发酵阶段添加AO-PEP，能够有效地降低啤酒浊度，提高啤酒的非生物稳定性，降低了为减轻浊度而添加聚乙烯基聚吡咯烷酮的操作成本。Yang Hongyu等[80]对米曲霉JN-412的脯氨酰氨肽酶（prolyl aminopeptidase，PAP）基因进行了密码子优化并插入表达载体pPIC9K，导入巴斯德毕赤酵母中成功表达，其胞内酶活力达到61.26 U/mL，是野生型的2.1 倍。Salamin等[81]将脯氨酰羧肽酶基因（AoS28D）在米曲霉NF1中进行过表达，转化后的菌株发酵后上清液酶活力最高可达到原始米曲霉NF1菌株的32 倍，极大提高了脯氨酰羧肽酶的表达量。

目前的技术手段不断更新，米曲霉中功能基因实现外源表达的成功实例越来越多，这也加快了相关技术的更新换代，如Katayama等[82]确立了一套高效的米曲霉多重基因工程技术，促进了对工业菌株的多基因修饰。相信在未来，对于米曲霉中蛋白基因的异源表达将会有更大的进展，其蛋白酶类及其他代谢产物的工业化生产也将迎来新的发展阶段。

6.3 组学技术应用

随着基因组学、转录组学、蛋白组学等技术的发展，基因、蛋白、细胞或个体间实现网络化连接，生物问题研究趋向层次化、系统化。将组学技术应用到菌种改造，可缩短育种时间、提高突变率、简化操作步骤。米曲霉的基因序列虽然已完成测定，但仍存在大量编码蛋白功能未知的问题。

Li Yuzhen等[83]通过对米曲霉3.042不同发育时段的转录组测序发现，一个未表征的基因（Aokap2）在米曲霉的生长和发育过程中表达受到抑制，为研究Aokap2的作用，将含有米曲霉amyB启动子且Aokap2过表达的质粒pEX2B-Aokap2导入米曲霉ΔpyrG菌株。结果显示，Aokap2基因表达量上调，米曲霉生长速度减慢，形成的孢子量减少，生物量降低了30%，曲酸产量增加了4 倍，Aokap2的发现为米曲霉生长和曲酸生产的基因改造提供了新的靶点，为其他菌种的研究提供参考。Jin Fengjie等[84]使用蛋白质组分析的方法探究参与控制生长和分化的转录因子SclR的功能，通过串联质量标签（tandem mass tag，TMT）标记ΔsclR突变株和对照菌株在液态培养下的胞内蛋白来实现蛋白半定量，结果显示，SclR主要参与米曲霉的碳代谢、碳水化合物代谢、次生代谢物的生物合成等，同时经实时荧光定量聚合酶链式反应辅助验证结果。组学技术应用将在未来的生物机理研究和工业生产应用中起到重要作用。

6.4 合成生物学技术

合成生物学结合了代谢工程和系统生物学概念，是各学科交叉融合发展的产物，旨在按照特定的目标设计、改造甚至从头合成目的产物，经优化和转化的生物体，可实现连续高效合成终产物的目标。Sakai等[85]将携带与桔霉素产生有关的pksCT、ctnA及4 个orf生物合成基因簇的粘粒CossCT转化至米曲霉NS4，成功组建了米曲霉次生代谢物的异源生产系统，构建了含trpC启动子控制的ctnA表达盒pNCtnA并将其导入转化子，结果显示菌株16-2reg4和16-2reg5中的桔霉素量为菌株16-2的400 倍。Brown等[86]将pgk启动子与高表达的转运蛋白基因C4T318构建质粒pShTh104并将其转化到米曲霉NRRL3488，转化子ShTh1040-22的苹果酸产量提高2 倍；在此基础上，将C4T318基因、丙酮酸羧化酶pyc基因和苹果酸脱氢酶mdh3基因转化到米曲霉NRRL 3488，转化子SaMF2103a-68产苹果酸质量浓度达154 g/L，结果说明pyc和mdh3基因加快了由丙酮酸转化成苹果酸的速度，促进苹果酸的积累和葡萄糖产量的增加。

通过合成生物学技术的定向改造，突破自然进化的局限，设计、改造和搭建具有特定功能的生物体系，能够缓解食物匮乏、环境污染、医疗资源和能源短缺等问题，因此，合成生物学在未来会有更广阔的应用前景。

7 结 语

米曲霉被广泛应用于食品酿造行业，如何有效提高其水解酶类活力或代谢物的合成能力成为重中之重。物理、化学、原生质体等诱变方式被广泛应用，虽然一定程度上可以实现育种目标，但其庞大的筛选工作及育种方向的不确定性使育种工作进展缓慢。如何提高菌种诱变后筛选的简易性和育种的正向突变概率是这些诱变方法改进的重要研究内容。从现在的发展趋势来看，采用基因编辑技术对于菌株遗传物质进行遗传改造最为直接有效，基因工程育种通过分子层面对酶或代谢产物的合成机理进行根本性地挖掘，便于将来能够更好地指导对优良米曲霉菌种的选育。随着科技发展，可结合各种组学和合成生物学技术，优化米曲霉改造路线，针对性地设计和改造菌种，借助精密的仪器设备和高效的生物元件，实现准确靶向突变、提高突变位点的稳定性和安全性，为培育优良性状的菌种提供相应的技术指导。