酶法改性技术及其在植物基肉制品中的应用研究进展

李同庆，张金闯*，陈琼玲，刘浩栋，王 强*

（中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193）

随着人口数量的增长，全球范围内面临着食物供给不足的严峻挑战。预计至2050年，全球人口将达到98亿，届时膳食中肉类需求量将达到4.55亿 t，预计将出现1亿 t左右的缺口[1]。另一方面，采用现代加工技术，以植物蛋白为原料开发植物基肉制品，对于缓解肉类资源短缺，减轻饲养业的环境负担，改善居民膳食结构等具有重要意义。然而，植物基肉制品产业发展面临诸多挑战，其中，产品口感和质地与动物肉差距较大是主要问题之一[2]。

蛋白质酶法改性具有反应条件温和、产物安全性高、无环境污染、过程易于控制等优点，在植物蛋白精深加工领域被广泛研究和应用，以达到改善产品风味、质地、提高消化率等目的。Liu Boye等[3]利用蛋白质谷氨酰胺酶（protein glutaminase，PG）处理小麦面筋蛋白水解物，将谷氨酰胺进行脱酰胺处理生成谷氨酸，利用鲜味掩盖水解物的苦味。张金闯[4]利用谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TG）对花生蛋白进行改性，发现质量分数0.2% TG处理结合高水分挤压能够促进新的二硫键和氢键生成，使结构更加稳定，改善花生拉丝蛋白的纤维结构品质。Fan Jiaxuan等[5]研究发现，漆酶可以促进黑麦面条中二硫键和其他化学键的形成，从而促进蛋白质的交联，形成网络结构。Chen Lin等[6]探究挤压预处理与水解酶处理联合应用对大豆分离蛋白溶解性的改良作用，大豆分离蛋白经挤压预处理、酶水解程度为8%～10%时，大豆分离蛋白的溶解度大于90%，而未经挤压预处理的大豆分离蛋白溶解度在酶水解程度为9.6%时的溶解度最高（69.1%），这表明挤压预处理和控制酶水解能够提高大豆分离蛋白质的溶解度。到目前为止，酶法改性在植物基肉制品方面的应用研究较少，在酶制剂的选择、交联效率提升等方面还有很多值得探索的课题。

本文首先对比分析植物蛋白和动物蛋白在必需氨基酸组成、化学结构以及品质功能特性的差异；然后重点介绍TG、漆酶等交联酶，碱性蛋白酶、中性蛋白酶等水解酶对蛋白质结构的修饰改性机理；最后概括酶法改性工艺分别在动物肉制品和植物基肉制品中的应用，并对酶法改性技术与挤压技术联合工艺在植物基肉制品中的应用前景进行展望。本文旨在为新型植物基肉制品产品研发和品质提升提供参考。

1 植物蛋白与动物蛋白化学结构和功能特性差异

植物蛋白是人类膳食中重要的蛋白质来源，占全世界蛋白产量的80%[7]，其具有来源广泛、价格低廉、营养品质高等特点，在人类健康饮食结构中发挥了重要作用。植物蛋白分子结构以复杂的多聚体形式存在，如大豆蛋白可分为2S、7S、11S、15S，其中7S和11S为主要成分（质量分数约为70%），7S蛋白分子由α＇、α、β3 个亚基通过疏水相互作用缔合，11S由6 个酸性亚基和6 个碱性亚基以二硫键连接构成[8]。植物蛋白具有一定的功能性质，如凝胶性、乳化性及发泡性等，但常常满足不了食品工业的需求，所以需要适当加工以改善营养价值或功能性质。Zhu Zhenbo等[9]利用高强度的超声处理核桃分离蛋白，使核桃蛋白的水溶性增加22%、乳化性增加26%及乳化稳定性增加41%，改善了核桃蛋白的功能属性。植物蛋白的功能性质改善能够拓宽其应用范围及加工条件，同时赋予其新的加工功能性质，经加工改善后的植物蛋白可作为一些成本较高的食品蛋白质配料的替代品，产生更好的经济效益。

动物肉是人类饮食的重要组成部分。动物肉中主要由肌肉组织、脂肪组织、结缔组织等构成，肌肉中的纤维具有复杂的层次结构，可分为肌原纤维蛋白（肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、肌钙蛋白）、肌浆蛋白和基质蛋白（胶原蛋白、弹性蛋白），1 根肌纤维（1 个肌细胞）的长度为1～40 mm，直径为20～100 mm[10]。动物蛋白在加热过程中疏水基团暴露，疏水作用加强，巯基氧化，进而促进了二硫键生成，蛋白质发生交联作用，同时肌原纤维二级结构发生重排，芳香族氨基酸残基暴露于分子表面，蛋白质疏水区域发生了局部改变[11]。但是加热变性后不同动物肉质地差别较大，猪肉的肌纤维排列相对紧凑，含有较多的脂肪，结缔组织较少，肉纤维相对较薄且柔软。鱼肉中约含质量分数15%～24%蛋白质，由于鱼类独特的运动方式，其肌纤维长度较短，结缔组织也较少[12]，口感细致嫩滑，易消化吸收（消化率约87%～98%）[13]。

豌豆纤维化蛋白[14]与猪肌原纤维蛋白[15]微观结构如图1所示。对比植物蛋白与动物蛋白的结构差异可知，植物蛋白多为球状，分子较对称，溶解性通常较好，而肉类蛋白多为纤维状，分子不对称，溶解度各不相同，大部分不溶于水[16]。从蛋白质变性温度来看，植物蛋白在较高温度下才会变性，而动物蛋白在较低温度下即可变性，如大豆球蛋白变性温度在90 ℃左右[16]，而肌球蛋白在40 ℃左右开始变性，50 ℃变性显著，肌动蛋白在66～73 ℃发生变性[17]。因此，植物蛋白通常需要更高的温度或更长的加热时间才能使蛋白结构伸展[18]，发生变性，从而进一步促进新结构形成、达到改善功能特性的目的。

图1 豌豆纤维化蛋白（A）[14]与猪肌原纤维蛋白（B）[15]电子显微镜图Fig.1 Electron micrographs of pea fibrous protein (A)[14] and porcine myofibrillar protein (B)[15]

从蛋白消化率来看，植物蛋白的消化率往往比动物蛋白低（表1），因为植物蛋白常与植酸、蛋白酶抑制剂、植物血凝素和鞣酸等影响蛋白质消化的抗营养因子共存[19]，降低了蛋白消化率。此外，植物蛋白的二级结构以β-折叠为主，而动物蛋白以α-螺旋为主[20]，结构上的差异也是植物蛋白消化率较低的原因。在必需氨基酸组成方面，动物蛋白的蛋白质消化率校正后的氨基酸得分（protein digestibility corrected amino acids score，PDCAAS）能够达到或更加接近1.00，氨基酸的比例更加均衡，而植物蛋白往往缺乏一种或多种限制性氨基酸（limiting amino acid，LAA），PDCAAS低，如大多数谷物蛋白的赖氨酸含量较低，豆类蛋白的含硫氨基酸（甲硫氨酸和半胱氨酸）含量较低。可将不同种类植物蛋白混合，使其限制性氨基酸互补，能够提高植物蛋白的营养品质，如豌豆和大米的PDCAAS指数较低，但将其组合可以将PDCAAS增加到1.00[21]，同时食品加工也可以提高蛋白质消化率和PDCAAS，如蒸煮条件下能够提高蛋白质的消化率[16]，将大豆制成大豆分离蛋白后其PDCAAS可由0.80增加至0.98[22]。

表1 不同蛋白质的消化率、PDCAAS、LAA对比[22-23]Table 1 Comparison of digestibility, protein digestibility corrected amino acids score and LAA of different proteins[22-23]

2 酶法改性对蛋白质结构的修饰作用

酶是一种高分子质量的球状蛋白质，具有线性氨基酸链和决定酶性质的特殊空间构象。酶法改性技术减少了化学试剂的使用，提高了工作效率，是一项安全、高效、绿色的新技术。蛋白质酶法改性的方法主要有共价交联作用、水解作用、脱酰胺作用和磷酸化作用等，所涉及的酶包括TG、多酚氧化酶、水解酶、磷酸酶以及过氧化氢酶等[24-25]。

2.1 酶法交联

酶法交联是指蛋白质在酶的作用下，促进蛋白质分子内或分子间的交联作用。交联后蛋白质分子结构发生变化，分子质量提高，可有效改善蛋白质的持水性、凝胶性等功能特性。漆酶（EC1.10.3.2）是一种具有交联能力的多酚氧化酶，其催化中心存在多个铜离子，所以也被称作多铜氧化酶[26]。其广泛存在于植物、真菌中，也有一些漆酶能够从细菌和昆虫中分离出来[27]。漆酶的肽链约由500～550 个氨基酸组成，漆酶分子由3 个杯状结构域紧密结合形成漆酶的球状结构，每个结构主要由β-折叠、α-螺旋及无规卷曲构成。漆酶的活性位点一般存在4 个铜离子，可分为3 种类型，I型和II型各1 个，III型2 个，其中I型铜离子是还原性底物的氧化位点，具有典型的蓝铜谱带，是漆酶外观为蓝色的主要原因。漆酶结构与交联蛋白过程如图2所示。

图2 漆酶结构（A）及其引起的蛋白质交联过程（B）[28]Fig.2 Laccase structure (A) and laccase-induced protein cross-linking process (B)[28]

漆酶可对4 个底物分子进行氧化，生成的自由基随后发生偶联反应，形成不同的共价连接产物。蛋白质中暴露的酪氨酸侧链作为漆酶氧化的底物，由此产生的苯氧自由基会自发进行蛋白质交联反应[27]。Cui Li等[29]采用漆酶诱导小麦醇溶蛋白，制备了表面光滑均匀、热稳定性增强、具有良好性能的蛋白纤维，且醇溶蛋白纤维的力学性能和水合稳定性得到改善。

TG（EC2.3.2.13）广泛存在于植物、动物及微生物当中，目前市场所用的TG大多为微生物来源，其酶学性质更加稳定，对蛋白选择范围更广，交联性能更好，在食品中的应用十分广泛。TG通过3 种途径对蛋白质结构进行修饰改性，分别为转氨基反应、交联反应、脱氨基反应，其中交联反应机理如图3所示，TG催化蛋白质的谷氨酰胺残基（酰基供体）和赖氨酸残基（酰基受体）之间的酰基转移反应，形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸肽键[30]。

图3 TG结构（A）及其引起的蛋白质交联过程（B）[30]Fig.3 Transglutaminase structure (A) and transglutaminase-induced protein cross-linking process (B)[30]

TG对蛋白质的结构修饰作用已被广泛研究，如大豆蛋白[31]、鱼肉蛋白[32-33]、乳清蛋白、酪蛋白[34]等，有研究也表明TG在诱导蛋白交联过程中对蛋白质的溶解性、乳化性、起泡性和凝胶化等功能性质有较大的影响[35]。Chin等[36]利用TG开发低脂低盐香肠，实验结果表明，添加质量分数0.3%的TG可以替代10%用于生产重组肉制品的乳化肉，从而改善肉制品的结构特性和交联性能，且不会产生不良影响。Herrero等[37]研究发现TG的引入极大地改变了肌球蛋白重链的结构，显著降低了α-螺旋结构的含量，增加了β-折叠的相对含量，改善了肌球蛋白硬度、弹性、内聚力和黏附性，从而产生了具有紧凑、有序结构构象的凝胶。此外，TG还会干扰蛋白质脂肪族侧链之间的疏水相互作用，进一步增强蛋白质的交联性能[38]。

2.2 酶法水解

酶法水解指蛋白质在酶的作用下降解成肽类或氨基酸（图4），是改造蛋白质组成、改善蛋白质品质的有效途径之一。碱性蛋白酶是一种在中性到碱性（pH 7～11）范围内具有活性的水解酶，其中心有1 个丝氨酸，属于内切酶，水解部位为芳香族或疏水性氨基酸的羧基[39]。除了能水解肽键，碱性蛋白酶还能够水解酯键、酰胺键以及具有转酯、转肽的功能。其水解作用机理为丝氨酸作用于肽键酰基，形成丝氨酸羟基、底物酰基和氨基的共价四联中间体，中间体易分解形成酰基-酶中间产物，期间伴随着肽键断裂，水分子进入后，氧原子攻击羰基上的碳原子，酰基-酶解离，蛋白质水解完成[40]。

图4 蛋白质酶法水解过程Fig.4 Protease hydrolysis process

常见的植物蛋白均可利用碱性蛋白酶进行水解[41]。张娅妮等[42]利用碱性蛋白酶水解核桃蛋白，结果发现酶解产物表面疏水性降低，而其溶解性、乳化性、起泡性及泡沫稳定性提高。李泓颉等[43]利用碱性蛋白酶酶解亚麻籽蛋白，酶解产物粒径减小，而蛋白分子更加柔韧，将其应用到冰淇淋中，结果发现加入质量分数4%的碱性蛋白酶酶解亚麻籽蛋白能够获得较高品质的冰淇淋。

中性蛋白酶是最早发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于焙烤食品工业、阿斯巴甜的合成、蛋白水解物苦味的去除、大米深加工领域以及医药治疗等方面，最适作用pH值在6.0～7.5之间，分子质量为35～40 kDa，等电点为8～9。大多数中性蛋白酶为含锌的金属蛋白酶，酶活性中心的锌离子起着催化桥梁作用，当其他金属与锌离子发生置换反应时，可改变蛋白酶的活性。陆晓滨等[44]在饼干生产过程中添加中性蛋白酶，结果发现中性蛋白酶能够显著改变小麦面团的流变学性质，降低面团弹性，能够有效抑制饼干的自然断裂。郭永等[45]利用中性蛋白酶处理豌豆分离蛋白，在酶添加量为5 U/g、pH 6.0、温度65 ℃下所得豌豆分离蛋白凝胶质地更加细腻柔软。

3 酶法改性工艺及其在动物肉制品和植物基肉制品中的应用

目前酶法改性工艺在肉制品加工中应用广泛，可提高产品的营养价值、提高产品风味、降低材料成本并提高生产效率、改善肉制品品质等。在提高肉制品营养价值方面，利用酶制剂降解蛋白生成的肽和氨基酸更容易被人体吸收。已有研究显示蛋白质在人体肠道内并不完全以氨基酸的形式被吸收[46]，而短链肽更容易且能够更快被机体吸收利用，且短链肽比氨基酸的渗透压更低，致敏性比多肽和蛋白低，能够被人体完全吸收和利用，在普通饮食不能满足蛋白营养需求的人群中有着广泛应用。此外，在提高产品风味方面，酶解蛋白可产生多种呈味肽，能够显著改善食品滋味与风味。Zheng Zhiliang等[47]利用微波联合蛋白酶酶解牛骨中蛋白质制备肉味香精，实验结果表明微波联合酶解技术改善了酶解效果，提高了水解产物的抗氧化性能与风味，对提高副产品的经济和营养价值具有重要意义。在改善肉制品嫩度方面，酶制剂也发挥着重要的作用，常见的嫩化酶主要包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等，可以有效水解肉制品中结缔组织蛋白和胶原纤维，在使肉制品嫩化、有利于人体消化吸收的同时能够产生小分子肽，提升肉制品风味。在肉制品重组方面，酶改性技术可以将碎肉重组，提高其经济效益，也可以将肉与其他功能物质重组，提高其营养价值。Ersoz等[48]在制作牛肉丸过程中加入TG，结果显示TG处理后的肌动蛋白和肌球蛋白密度降低，形成了新的高分子质量蛋白质，TG处理促进牛肉丸网状凝胶结构形成，提高了牛肉丸的品质。Jiao Xidong等[49]在鲶鱼鱼糜中添加7.5 g/kg脂肪酶，结果显示凝胶强度明显增加，在鱼糜中加入脂肪酶后，相互作用力和二硫键作用显著增强，而离子键和氢键作用减弱。程梦颖等[50]研究了对鲢鱼鱼糜凝胶特性的影响，在葡萄糖氧化酶添加量为5‰时，鱼糜的白度、凝胶强度、弹性模量（G＇）、损耗模量（G″）及持水性都达到最大值，在1‰～5‰的添加范围内，凝胶网络变得更加致密，促进蛋白质分子间二硫键形成。

如表2所示，酶法改性技术在植物基肉制品生产中已得到应用，其可以改善产品外观、质构品质和风味等。TG、PG及漆酶均能够有效改善植物基肉制品的品质，Pöri等[51]利用PG与TG复配处理燕麦浓缩蛋白，同时探究了燕麦浓缩蛋白预热处理对挤出物的影响，结果表明，加入总酶活力为5 U的TG、PG混合酶进行酶解后，预热处理的燕麦浓缩蛋白能够促进高水分挤出物纤维结构的形成。Sakai等[52]用漆酶处理添加了甜菜果胶和甜菜红色素的植物基肉饼，改善了植物基肉饼的色泽，同时也发现漆酶处理后能够改善肉饼的硬度，增强肉饼的保水性、多汁性及减少其蒸煮损失，提高产品品质。Zhang Jinchuang等[53]研究发现TG能够促进花生蛋白高水分挤出物的层状结构形成速率，从而促使纤维结构的形成，TG可以促进蛋白质分子链的展开、聚集、交联，使蛋白质分子排列更加无序，同时，α-螺旋结构会向β-转角和无规卷曲结构转变。Lee等[54]用TG增强了大豆饼的硬度、弹性和咀嚼度，但降低了油脂吸收率。Kaleda等[55]将豌豆分离蛋白与燕麦浓缩蛋白原料混合后，利用高水分挤压技术生产植物基肉制品，研究发现产品的必需氨基酸比例能够达到联合国粮食及农业组织/世界卫生组织氨基酸模式标准，同时，在挤压过程中加入植酸酶减少了植酸含量，提高了植物基肉制品营养价值。然而，相比动物肉制品，酶法改性在植物基肉制品开发中研究较少、应用不足，在酶制剂的选择、交联效率提升等方面还有很大的提升空间。

表2 酶法改性植物基肉制品研究进展Table 2 Research progress of enzymatic modifications of plant-based meat products

4 酶法改性-挤压联用技术工艺及其特点

食品挤压技术是集混合、搅拌、破碎、加热、蒸煮、膨化及成型等过程为一体的高新食品加工技术，具有高效率、低能耗，少排放、低成本，高温短时、营养损失小等特点[56-57]。根据螺杆数量的不同，可分为单螺杆挤压、双螺杆挤压和多螺杆挤压；根据物料水分质量分数的不同，可分为低水分（20%～40%）挤压和高水分（40%～80%）挤压[58]。在挤压过程中，蛋白分子中原有的化学键断裂，分子链伸展，分子内或分子间发生交联、聚集、降解、氧化等反应[59]，能够使蛋白质分子形成新的有序的网状纤维结构[60]。在挤压过程中高压和高温的环境下，植物蛋白的抗营养物质、过敏源等也会被破坏，从而可提高其消化率[16]、降低植物蛋白致敏性[61]。低水分挤压由于模口处温度和压力骤降，制得的拉丝蛋白呈蓬松多孔结构，水分含量低；而高水分挤压具有更长的冷却模具，可同时完成调色、调味、熟化、杀菌、组织化等工序，不仅生产过程能耗低、营养损失小、无需后续加工等优点，而且产品更接近动物肉的纤维结构和质地，可作为较为理想的动物蛋白部分替代品。因此，高水分挤压被认为是目前最具潜力的新型植物基肉制品加工技术之一[62]。Zhang Jinchuang等[63]利用高水分挤压技术将花生蛋白制备植物基蛋白肠，结果表明，在挤压过程中蛋白质分子结构伸展，在冷却区发生相分离和重排，形成的氢键和二硫键促使肉状纤维结构的形成。Zhang Xin等[64]利用高水分挤压技术研究了不同比例的大豆浓缩蛋白和小麦蛋白对挤出物纤维结构的影响，结果发现质量比在1∶1的条件下挤出物呈现出高纤维结构，同时也证明了氢键和二硫键是纤维结构形成的原因。

酶法改性与挤压联用技术是在物料挤压过程中引入外源酶，将挤压机作为酶的反应器，以加强对生物大分子的改性作用。植物蛋白大多为球状，温和条件下难以直接作用基质，因此酶水解、酶交联等效果较差。在挤压过程中蛋白质分子由聚合状态转变为暴露状态，增加了酶与底物的接触位点数量（图5），同时在强外力下蛋白与酶混合均匀，有利于酶与底物在多个方向充分接触，从而能够改善酶作用效果[65]。de Mesa-Stonestreet等[66]将酶法改性与挤压技术相结合用于从高粱粉中提取出蛋白质，结果发现，提取出的蛋白质的浓度和消化率都高于用仅酶处理所提取的蛋白质。Zhang Jinchuang等[53]研究表明在花生蛋白中添加一定量（质量分数0.1%～0.2%）TG，有利于促进高水分挤压花生蛋白纤维结构的形成和拉伸强度的提高，但过量（质量分数0.3%）的TG不利于蛋白纤维结构的生成。然而，如何实现酶法改性技术与高水分挤压技术的有机结合，对蛋白质结构进行精细改良，用于新型植物基肉制品品质改良和产品创制仍需进一步探索。

图5 酶法改性与挤压技术联用对蛋白质构象的改变Fig.5 Conformational changes of proteins by enzymatic modification in combination with extrusion

5 结 语

以植物蛋白为原料开发植物基肉制品部分替代动物肉，在可持续发展、低碳减排、营养需求等方面具有重要意义。然而，由于天然植物蛋白在氨基酸组成、分子间作用力、空间构象等方面与动物蛋白存在较大差异，难以直接模拟由肌动蛋白和肌球蛋白构成的肌纤维及肌束的结构，限制了其在植物基肉制品产业中的应用。酶法改性技术作为一项安全、高效、绿色的新技术主要分为酶法交联和酶法水解两种，已在动物肉制品中广泛应用，可提高产品的营养价值、提高产品风味、降低材料成本并提高生产率、改善肉制品品质等，同时，酶法改性技术在植物基肉制品中也展现出了良好应用前景。将酶法改性技术与高水分挤压技术联用，以挤压机作为蛋白质酶法改性的反应器，在蛋白质结构修饰和品质形成方面具有显著优势，对于生产出纤维结构更加丰富、质构更加拟真的植物基肉制品具有重要作用。