环保脱蜡液用于坏死性肉芽肿性炎抗酸染色的效果

李婷 王羚 胡佳莉 杨洋 汪亮亮 王德田

［摘要］ 目的

探讨环保脱蜡液对坏死性肉芽肿性炎石蜡切片的抗酸染色效果。

方法 回顾性收集病理诊断结果为坏死性肉芽肿性炎的163例组织标本作为研究对象，分别使用二甲苯（二甲苯组）和环保脱蜡液（环保脱蜡液组）作为切片的透明脱蜡液。采用齐-内抗酸染色法检测两组切片的结核分枝杆菌，比较两组切片的抗酸染色效果、結核分枝杆菌阳性率和数量及两组切片的结核分枝杆菌的符合率和诊断吻合系数。

结果 两组切片抗酸染色均背景清晰，呈灰蓝色；细胞核蓝色，胞浆粉红色；结核分枝杆菌清晰可见，呈鲜红色；肺泡腔内壁见粉染渗出物。环保脱蜡液组切片的结核分枝杆菌阳性率高于二甲苯组，差异有统计学意义（χ2=105.20，P＜0.001）。两组切片的结核分枝杆菌符合率为87.12%，结核分枝杆菌诊断吻合度较强且差异有统计学意义（kappa=0.723，P＜0.001）。环保脱蜡液组检出的结核分枝杆菌均数高于二甲苯组，差异有统计学意义（t=40.106，P＜0.001）。

结论

与二甲苯相比，使用环保脱蜡液有利于提高坏死性肉芽肿性炎石蜡切片的结核分枝杆菌抗酸染色检出率和数量。

［关键词］ 坏死性肉芽肿性炎；抗酸染色；结核分枝杆菌

［中图分类号］ R365

［文献标志码］ A

［文章编号］ 2096-5532（2023）06-0890-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.181

［网络出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20231220.2243.005;2023-12-22 10：34：05

ACID-FAST STAINING EFFECT OF ENVIRONMENTAL FRIENDLY DEWAXING SOLUTION FOR NECROTIZING GRANULO-

MATOUS INFLAMMATION

LI Ting， WANG Ling， HU Jiali， YANG Yang， WANG Liangliang， WANG Detian

（Department of Pathology， Jiujiang University Affiliated Hospital， Jiujiang 332000， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the acid-fast staining effect of environmental friendly dewaxing solution for paraffin sections of necrotizing granulomatous inflammation.

MethodsA total of 163 tissue sections of pathologically diagnosed necroti-

zing granulomatous inflammation were retrospectively divided into two groups： using either xylene or environmental friendly dewaxing solution as transparent dewaxing solution. The Ziehl-Neelsen method was used to detect tuberculous mycobacteria in both groups. The two groups were compared in the acid-fast staining effect and the positive rate and number of tuberculous mycobacteria. The coincidence rate and coincidence coefficient for tuberculous mycobacteria detection of the two groups were calculated.

ResultsThe acid-fast-stained sections in both groups showed a clear gray-blue background; blue nuclei surrounded by pink cytoplasm; clearly visible bright red tuberculosis mycobacteria; and pink-stained exudates inside the wall of the alveoli. The positive rate of tuberculosis mycobacteria in the environmental friendly dewaxing solution group was significantly higher than that of the xylene group （χ2=105.20，P<0.001）. The coincidence rate of tuberculosis mycobacteria between the two groups was 87.12%. The coincidence degree of tuberculous mycobacteria detection was relatively high， which was statistically significant （kappa=0.723，P<0.001）. The mean number of tuberculosis mycobacteria detected in the environmental friendly dewaxing solution group was significantly higher than that in the xylene group （t=40.106，P<0.001）.

ConclusionCompared with using xylene， the use of environmental friendly dewaxing solution can help improve the positive rate and number of tuberculous mycobacteria detected with acid-fast staining in paraffin sections of necrotizing granulomatous inflammation.

［KEY WORDS］necrotizing granulomatous inflammation; anti-acid staining; mycobacterium tuberculosis

结核是严重危害人类健康的主要传染病［1］。我国第五次结核病流行病学调查发现，结核病年发病100万例，发病率为78/10万［2］。结核病的病原菌90%以上为结核分枝杆菌，因其菌体壁上含有脂质，一般染料不易着色，但是经过抗酸染料染色后呈红色，且可抵抗盐酸乙醇的脱色［3］。病理学检查是诊断结核病的重要途径，尤其在痰菌阴性肺结核和肺外结核等疑难诊断中有重要作用［4］。最经典的结核分枝杆菌病理学检查方法是齐-内染色法。脱蜡是切片进行特殊染色的必须步骤，传统脱蜡液二甲苯能溶解石蜡。但是由于二甲苯的毒性作用大，可对操作人员造成危害［5］；而且二甲苯會造成脂质和菌体壁溶解，导致结核分枝杆菌结果为假阴性［6］，故齐-内染色法检测结核分枝杆菌过程中不建议使用二甲苯脱蜡。因此，寻找一种环保、高效脱蜡而又能保护结核分枝杆菌的组织处理液是必要的。本文探讨环保脱蜡液对坏死性肉芽肿性炎石蜡切片的抗酸染色效果。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂及仪器 40 g/L甲醛中性固定液购于南昌雨露实验器材有限公司；二甲苯购于天津市恒兴化学试剂制造有限公司；石碳酸复红病理抗酸染色液购于珠海贝索生物技术有限公司；BLB-01生物组织样本切片染色脱蜡液（环保脱蜡液）购于北京九州柏林生物科技有限公司。ASP300S 全封闭式组织脱水机、HistoCore Arcadia H石蜡包埋系统、HistoCore BIOCUT 切片机和DM2000 LED生物显微镜购于德国徕卡公司；DRS-Prisma-P-JCS全自动染色封片一体机购于日本樱花公司。

1.1.2 标本及其来源 回顾性收集2016年1月—2022年3月九江学院附属医院送检、病理证实为坏死性肉芽肿性炎，并且具有结核分枝杆菌抗酸染色结果（使用二甲苯作为透明脱蜡液，二甲苯组）的163例组织标本作为研究对象，对其留存蜡块重新切片后再次进行抗酸染色（使用环保脱蜡液作为透明脱蜡液，环保脱蜡液组）。163例病人中男86例，女77例，年龄6.59～75.68岁，平均（43.95±10.96）岁。组织来源部位：肺组织62例，淋巴结29例，胸膜及纤维板16例，腋下包块15例，肠及肠黏膜9例，腹部包块6例，颈部包块5例，输卵管5例，大网膜3例，乳腺3例，膝关节3例，扁桃体2例，睾丸2例，子宫内膜2例，后腹膜肿物1例。

1.2 研究方法

1.2.1 组织标本的前期处理 病理组织离体后30 min内放入40 g/L甲醛中性固定液中固定12 h，

常规组织取材，放入脱水机中进行固定、脱水、透明、浸蜡等步骤。程序如下：40 g/L甲醛中性固定液固定2 h；梯度乙醇脱水（体积分数0.75乙醇脱水70 min，体积分数0.80乙醇脱水70 min，体积分数0.85乙醇脱水60 min，体积分数0.90乙醇脱水60 min，体积分数0.95乙醇脱水60 min，体积分数1.00乙醇Ⅰ脱水60 min，体积分数1.00乙醇Ⅱ脱水50 min），二甲苯Ⅰ透明50 min，二甲苯Ⅱ透明40 min；石蜡Ⅰ浸蜡45 min，石蜡Ⅱ浸蜡45 min，石蜡Ⅲ浸蜡45 min，石蜡Ⅳ浸蜡30 min。

1.2.2 苏木精-伊红（HE）染色 组织切片于65 ℃烤箱中烤片30 min，然后进行HE染色：二甲苯Ⅰ脱蜡5 min，二甲苯Ⅱ脱蜡5 min；体积分数1.00乙醇Ⅰ脱二甲苯2 min，体积分数1.00乙醇Ⅱ脱二甲苯2 min，体积分数0.95乙醇Ⅰ脱二甲苯和水化2 min，体积分数0.95的乙醇Ⅱ脱二甲苯和水化2 min，体积分数0.80乙醇脱二甲苯和水化1 min；水洗1 min；苏木精染色8 min；水洗1 min；体积分数0.01盐酸乙醇分化2 s；水洗2 s；氨水返蓝10 s；水洗1 min；50 g/L伊红染色2 min；水洗2 s；体积分数0.80乙醇脱水30 s，体积分数0.95乙醇Ⅰ脱水2 min，体积分数0.95乙醇Ⅱ脱水2 min，体积分数1.00乙醇Ⅰ脱水3 min，体积分数1.00乙醇Ⅱ脱水3 min；二甲苯Ⅰ透明4 min，二甲苯Ⅱ透明4 min，二甲苯Ⅲ透明4 min；中性树胶封片，显微镜下观察HE染色结果。坏死性肉芽肿性炎的组织学诊断由两位资深病理医师共同完成。

1.2.3 齐-内法检测结核分枝杆菌 将组织学诊断结果为坏死性肉芽肿性炎的蜡块制作6 μm厚的切片，使用环保脱蜡液进行脱蜡（10 min×3次），水洗，滴加石碳酸复红溶液于切片上，65 ℃烤箱里加热至冒蒸汽后停止加热；染色5～10 min，水洗，将水分沥干或以滤纸吸干，

滴加酸性乙醇溶液脱色1～

2 min，水洗（若切片上还有红色残存，则滴加酸性乙醇溶液作用至红色消失，然后继续水洗），滴加苏木精25 s，水洗；吹干切片水分，中性树胶封固，显微镜下观察染色结果。实验过程中设置了不含结核分枝杆菌的阴性对照和含结核分枝杆菌的阳性对照。

1.2.4 结核分枝杆菌染色结果观察 结核分枝杆菌抗酸染色呈鲜红色，多数为杆状、稍弯曲；少数菌体较长者可呈螺旋状、两端稍钝，背景呈灰蓝色，细胞核蓝色，胞浆粉红色，肺泡内壁见粉染渗出物。参照相关文献标准［4］，在400倍显微镜下观察50个视野，未找到结核分枝杆菌判读为阴性，发现1条以上的结核分枝杆菌判读为阳性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，数据间比较采用t检验；计数资料以百分数表示，数据间比较采用χ2检验。诊断吻合度采用kappa系数检验，kappa≥0.7表示吻合度

较强；0.7＞kappa≥0.4表示吻合度一般，kappa＜0.4示吻合度较弱。P<0.05表示差异有显著意义。

2 结  果

2.1 两组结核分枝杆菌的抗酸染色效果比较

显微镜下观察，二甲苯组和环保脱蜡液组石蜡切片结核分枝杆菌抗酸染色的背景清晰，呈灰蓝色；细胞核蓝色，胞浆粉红色，结核分枝杆菌清晰可见，呈鲜红色；6例肺结核重症病人的肺泡内壁见粉染渗出物，可能是肺透明膜形成（图1A1、A2、B1、C1、C2）。二甲苯处理组有19例未见结核分枝杆菌（图1B1），改用环保脱蜡液处理后切片可见鲜红色结核分枝杆菌（图1B2）；二甲苯组结核分枝杆菌阳性的切片（图1C1）改用环保脱蜡液处理后，结核分枝杆菌的数量增加（图1C2）。

2.2 两组结核分枝杆菌阳性率、符合率及诊断吻合度比较

二甲苯组和环保脱蜡液组切片的结核分枝杆菌阳性率分别为30.67%（50/163）、41.10%（67/163），环保脱蜡液组切片的结核分枝杆菌阳性率高于二甲苯组，差异有统计学意义（χ2=105.20，P<0.001）。两组切片的结核分枝杆菌符合率为87.12%（（48+94）/163）。见表1。二甲苯组和环保脱蜡液组切片的结核分枝杆菌诊断吻合系数kappa=0.723，吻合度较强，差异有统计学意义（P<0.001）。

2.3 两组切片结核分枝杆菌均数比较

二甲苯组和环保脱蜡液组切片结核分枝杆菌均数分别为（235.68±45.11）、（592.06±49.28）条，差异有统计学意义（t=40.106，P<0.001）。

3 讨  论

为鉴别可疑凝固性坏死和结核样结节，了解结核病变中结核分枝杆菌存在的情况和病变情况，常需做结核分枝杆菌的特殊染色检测，即抗酸染色。结核分枝杆菌菌体内含有脂质、蛋白质和多糖，并由糖脂形成一个蜡质的外壳，该外壳能与齐-内染色法的石碳酸复红溶液结合成复合物，该复合物能抵抗酸性乙醇溶液脱色，因此，该方法染色能把结核分枝杆菌清晰显示出来。

结核分枝杆菌检出率偏低仍然是目前大多数医院普遍存在的病理难题。一个非常重要的原因就是使用的透明脱蜡液不恰当。为解决这一学科问题，本研究通过对比二甲苯和环保脱蜡液用于坏死性肉

芽肿性炎石蜡切片的抗酸染色效果，探讨一种环保而恰当的透明脱蜡液。本文研究结果显示，两种方法抗酸染色的形态效果均能达到三甲医院诊断的要求，19例经二甲苯处理后未见结核分枝杆菌的切片，改用环保脱蜡液后切片出现了鲜红色结核分枝杆菌。说明二甲苯用于新鲜组织脱蜡的结核分枝杆菌检出率不及回顾性石蜡切片使用的环保脱蜡液。原因可能是因为二甲苯脱蜡溶解了菌体脂质，损伤了菌体壁结构，进而造成了抗酸菌的抗酸性减弱甚至消失。相关研究显示，使用环保型脱蜡剂替代二甲苯脱蜡效果佳，抗酸染色的結果与二甲苯脱蜡效果非常接近［7］。本文研究二甲苯组和环保脱蜡液组切片的抗酸染色并非同一时间段完成，环保脱蜡液组的切片是对留存蜡块重新切片后再次行抗酸染色，侧重于追踪环保脱蜡液对放置了一段时间蜡块的抗酸染色效果。

石蜡的化学结构为直链烷烃，二甲苯的化学结构为环族芳香烃化合物；本研究使用的环保脱蜡液的主要成分是异丙醇，化学式是C3H8O，为无色透明液体。透明脱蜡遵循的原理是“相似相溶”，本文以石蜡的直链烷烃为基准，与二甲苯相比，环保脱蜡液的结构与石蜡的结构更相似，因此，环保脱蜡液与石蜡的互溶性更大。本研究结果显示，环保脱蜡液组切片结核分枝杆菌的形态学、阳性率和数量均优于二甲苯组，证实了环保脱蜡液透明脱蜡效果更优。有研究应用病理组织环保透明剂、汽油、松节油和GSA-08脱蜡剂代替二甲苯进行脱蜡处理，结果显示，病理组织环保透明剂抗酸染色效果最佳［8］。本文结合二甲苯组和环保脱蜡液组切片的结核分枝杆菌阳性率、符合率和诊断吻合系数以及结核分枝杆菌均数等指标，从多个维度探讨了环保脱蜡液用于坏死性肉芽肿性炎病理石蜡切片抗酸染色性能，结果显示，尽管石蜡切片已经放置了一段时间，但是使用环保脱蜡液作为石蜡切片的处理液，对结核分枝杆菌的检出率和检出数量优于二甲苯的处理效果。说明环保脱蜡液在溶解石蜡的同时，维系了菌体壁的结构完整性，因此，对于石蜡切片结核分枝杆菌的检测效果更优。

本研究结果显示，环保脱蜡液组的结核分枝杆菌阳性率为41.10%，与相关研究报道的37.19%～58.00%阳性率基本一致［9-10］。此外，为论证环保脱蜡液的实用性，本文比较了两组结核分枝杆菌的数量的差异，这在国内外文献中尚未见报道。受研究时限和标本来源于单中心以及标本数量的限制，本研究可能存在一定的抽样误差；阳性率与标本本身的含菌量也密切相关，故本文结论可能存在一定的局限性。环保脱蜡液越来越被众多实验室使用，我们下一步的研究目标是进一步加大多中心实验室的科研合作力度，尽可能收集更多经痰涂片检查和聚合酶链式反应等技术方法确诊的结核标本，对比和验证环保脱蜡液制作的石蜡切片结核分枝杆菌阳性率和数量的检测效果，以排除假阳性和发现更多的真阴性病例，为临床的精准诊疗提供有力依据。

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（本文編辑 黄建乡）