结核分枝杆菌Erp蛋白PGLTS的4基序突变体的构建

郝秀静　马超　李敏

摘要：以结核分枝杆菌H37Ra DNA为模板，通过PCR扩增，获得靶基因erp片段。采用重叠延伸PCR的方法得到erp基因PGLTS的4基序的突变体，依次删除突变体的C-末端、N-末端和C/N-端，构建重组质粒pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4，转化BL21（DE3）pLysS。对重组菌株IPTG诱导后的表达产物进行Tricine SDS-PAGE，得到大小分别约为11.2、15.4、4.8 ku的目的蛋白。Western blotting分析结果表明，目的蛋白表达特异。

关键词：结核分枝杆菌；重复输出蛋白；重叠延伸PCR；PGLTS；原核表达

中图分类号：S855.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0031-03

牛结核病是影响养牛业最为严重的疫病之一，且该病为人畜共患传染病，既造成了极大的经济损失还严重威胁着人类健康，其主要致病菌为牛结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）[1]。重复输出蛋白（exported repeated protein，ERP）是牛结核分枝杆菌上的一个重要毒力因子[2]，别称P36、Pirg或Rv3810，它是一种分泌蛋白，存在于结核分枝杆菌复合体所有成员（结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡介苗和田鼠分枝杆菌）中[3]，而在其他细菌种内没有发现同族体，使得Erp成为结核分枝杆菌家族的一个特异信号分子。ERP蛋白全长为284个氨基酸，由3个不同区域组成，其中1～22个氨基酸是信号肽序列，中心是基于PGLTS基序的12个重复区[4]，N-末端结构域（氨基酸1～80）和C-末端结构域（氨基酸176～284）高度保守。N-末端含有运送Erp通过质膜的信号肽序列，由22个氨基酸组成，带正电荷的碱性氨基酸（尤其是精氨酸和赖氨酸）含量较为丰富，对于蛋白质定位和导肽序列识别有一定作用[5-6]。C-末端富含疏水性氨基酸，可能与膜骨架网络和细胞质膜之间的连接有关，Kocincova等证实Erp蛋白疏水性 C-末端的作用——将Erp锚定在细菌表面[7]。中间是PGLTS重复区，它的重复区具有一定的可变性，如麻风分枝杆菌的PGLTS 重复区是4基序、牛结核分枝杆菌是12基序、而耻垢分枝杆菌是21基序[5]。为研究 Erp 的 PGLTS 区基序变化以及C-端、N-端与功能的关系，本研究通过查询GeneBank中erp基因序列，以结核分枝杆菌H37Ra DNA为模板，通过PCR扩增，获得靶基因erp片段。采用重叠延伸PCR的策略，得到含4基序的PGLTS突变体及基序 C-端、N-端和 C/N-端缺失突变体并构建到原核表达载体中，经IPTG诱导表达，为以后进一步深入研究其基序变化以及C端、N端功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

结核分枝杆菌H37Ra、大肠杆菌DH（5α）和质粒pET28a（+）由西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室保存，MD18-T Vector、BL21（DE3）pLysSp购自Transgene公司。

1.2 试剂与仪器

限制性核酸内切酶HindⅢ、KpnⅠ、XhoⅠ，T4 DNA连接酶和Wizard PCR preps DNA Purification System为Promerga公司产品；Taq PCR MasterMix试剂盒、Pfu PCR MasterMix试剂盒、HRP-DAB底物显色试剂盒、D2000等DNA marker、100 ku 等预染蛋白质marker为天根生化科技（北京）有限公司产品；IPTG、X-Gal、氯霉素、氨苄青霉素购自Sigma公司；胰化蛋白胨（tryptone）、酵母提取物（yeast extract）为OXOID产品；氨基乙酸（甘氨酸）、琼脂粉等化学试剂为索莱宝公司产品。

1.3 引物设计

利用Primer Premier 5.0设计的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，主要包括：

其中，小写字母表示保护性碱基，下划线表示酶切位点，长引物PN1表示在5′端加上Erp信号肽序列。

1.4 野生型erp序列扩增

以结核分枝杆菌H37Ra基因组DNA为模板，引物EP1、EP2扩增erp。50.0 μL反应体系包括20 ng/μL DNA 1.0 μL、10 mol/L上游引物2.0 μL、10 mol/L下游引物 2.0 μL、2×Taq PCR MasterMix 25.0 μL、ddH2O 20.0 μL。反应条件为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性1 min，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，扩增30个循环；72 ℃延伸 7 min。反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 ERP 4基序突变体的构建

1.5.1 ERP 6基序突变体的构建 利用重叠延伸技术，以EP1、EP3和EP2、EP4为引物，以重组质粒pMD18-T-E为模板，依次经过第1、第2轮PCR扩增得到erp 6个基序的突变体片段，连接到pMD18-T载体上，命名为pMD18-T-6。

1.5.2 ERP 4基序全长突变体的构建 利用重叠延伸技术，以EP1、EP5和EP2、EP6为引物，以重组质粒pMD18-T-6为模板，依次经过第1轮、第2轮PCR扩增得到erp 4基序的序列片段。

1.6 4 基序缺失突变体的表达载体构建 以EP7、PN1、PN2、PC、EP8为引物，以pMD18-T-4为模板，扩增erp 4基序 C-端、N-端和C/N-端缺失基因片段。缺失基因扩增产物和表达载体pET28a（+）连接，构建4基序为PGLTS突变体C-端、N-端和C/N-端缺失的原核表达载体，并命名为pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4。

1.7 核苷酸序列测定

利用ABI PRISM 3730 核苷酸序列分析仪，对质粒pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4进行核苷酸序列测定，以获得erp（4基序）的突变序列，具体工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.8 IPTG诱导表达重组蛋白并检测

接种环划线BL21（DE3）plsys（pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4），过夜培养12 h，挑取单个菌落，接种于含30 μg/mL Kan的LB培养基中，于37 ℃、180 r/min下培养 12～16 h。将该菌液以1%接种量接种于含30 μg/mL Kan LB培养基的三角瓶中，于37 ℃、180 r/min下摇瓶3 h，加入 IPTG 使终浓度达到1 mmol/L，于32 ℃、180 r/min下过夜诱导表达，进行SDS-PAGE检测。

1.9 重组表达产物的SDS-PAGE及Western blotting分析

将挑取的阳性菌落进行培养，加入IPTG，于32 ℃下过夜诱导表达，收集菌体，提取蛋白后进行SDS-PAGE检测及Western blotting分析，检测时阳性血清为1 ∶ 200 倍稀释的兔阳性血清，二抗为1 ∶ 800 倍稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG。

2 结果与分析

2.1 野生型erp序列扩增

利用PCR技术从结核分枝杆菌H37Ra基因组DNA中扩增出大小约为855 bp的基因片段（图1），连接到pMD18-T载体中。

2.2 ERP 4基序突变体的构建

2.2.1 ERP 6基序突变体的构建 利用重叠延伸技术，以EP1、EP3和EP2、EP4为引物，以重组质粒pMD18-T-E为模板，依次经过第1轮（图2）、第2轮（图3）PCR扩增得到erp 6个基序的突变体片段，连接到pMD18-T载体中。将含有目的基因的重组质粒分别进行酶切鉴定和序列测定，与预期结果一致，将重组质粒命名为pMD18-T-6。

2.2.2 ERP 4基序全长突变体的构建 利用重叠延伸技术，以EP1、EP5和EP2、EP6为引物，以重组质粒pMD18-T-6为模板，依次经过第1轮（图4）、第2轮（图5）PCR扩增得到erp 4基序的序列片段。

2.3 4基序缺失突变体及其表达载体的构建

利用PCR技术，以EP9、PN1、PN2、PC、EP10为引物，以pMD18-T-4为模板，扩增erp 4基序 C-端、N-端和C/N-端缺失基因片段，分别为405、495、231 bp的产物（图6）。

缺失基因扩增产物和表达载体pET28a（+）经过HindⅢ和XhoⅠ双酶切，经Wizard PCR preps DNA Purification System试剂盒纯化回收后用T4 DNA Lingase进行连接，4 ℃过夜，连接产物转化至BL21（DE3）pLysS 中，提取质粒进行酶切鉴定（图7），将筛选得到的阳性重组子分别命名为pET28a-C4、

pET28a-N4、pET28a-CN4。对其进行核苷酸序列测定，结果表明其基因序列和阅读框架正确。

2.4 IPTG诱导表达重组蛋白及SDS-PAGE分析

将用于毒性蛋白表达的BL21（DE3）pLysS菌株作为pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4融合基因的表达宿主菌，经转化挑取单个菌落培养，IPTG过夜诱导，菌体处理后，用Tricine SDS-PAGE分析，结果表明菌体中含有目的蛋白（图8），分子量大小分别约为11.2、15.4、4.8 ku，与理论值相符，表明融合基因可在BL21（DE3）pLysS中实现表达。

2.5 表达产物的 Western blotting分析

BL21（DE3）pLysS（pET28a-C4）、BL21（DE3）pLysS（pET28a-N4）和BL21（DE3）pLysS（pET28a-CN4）表达产物进行Western blotting试验分析，结果表明，重组蛋白可以被His-Tag特异性抗体识别，在约11.2、15.4、4.8 ku处出现识别条带，而阴性对照在相同的位置没有条带（图9），表明毒性蛋白在宿主菌中特异表达。

3 结论与讨论

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种人畜共患病，它严重威胁人类健康，大约每年导致180万人死亡[8] 。erp基因是结核分枝杆菌中一个重要的毒力基因，Christine等研究发现Erp 蛋白在分枝杆菌的细菌壁渗透性屏障形成中起重要作用，Erp缺陷可造成细菌壁通透性的缺陷，使之可以透过一些亲脂性物质，致使细菌对宿主的防御反应敏感，如活性氧、活性氮和防御素等可以透过细菌壁而对细菌起到杀伤作用[9]。Erp不仅仅是一种毒力因子，在麻风结核杆菌中还是一种免疫优势抗原，可以诱发机体的细胞免疫和体液免疫。早期研究空洞和非空洞结核病患者时发现，Erp蛋白仅可以刺激空洞性结核病患者机体产生抗体，而在结核病潜伏感染者体内很少甚至没有抗体产生[10]。

Kyte-Doolittle分析Erp蛋白时显示，C-末端富含疏水性氨基酸可能与膜骨架网络和细胞质膜之间的连接有关。Kocincova等对耻垢结核分枝杆菌Erp进行突变，阐释该蛋白疏水性C-末端将Erp锚定在细菌表面。ERP蛋白的N-端，PGLTS 重复区序列的不同对该蛋白质的致病性和输出运输具有较大的影响，但是目前在ERP基序变化以及C、N端功能方面的研究还不是很清楚。

本试验成功克隆了结核分枝杆菌erp，对erp进行一系列突变，得到4个基序的突变体，以pET28a（+）为载体构建大肠杆菌融合表达系统——BL21（DE3）pLysS（pET28a-C4）、BL21（DE3）pLysS（pET28a-N4）和BL21（DE3）pLysS（pET28a-CN4），经Tricine SDS-PAGE检测，目的蛋白大小为11.2、15.4、4.8 ku。Western blotting结果显示，目的蛋白能被特异性抗体识别，本研究结果为进一步研究Erp的功能奠定了基础。

参考文献：

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