ApoD对多巴胺能神经元Basigin表达影响

栾梦瑶 阎春玲 姜宏

［摘要］ 目的

探究载脂蛋白D（Apo D）对多巴胺能神经元Basigin（BSG）蛋白表达的影响。

方法 小鼠侧脑室埋入不锈钢管套，并给予外源性Apo D处理。培养鼠多巴胺能神经元细胞MES23.5细胞，并给予外源性Apo D处理。采用Western Blotting方法分别检测小鼠黑质区和MES23.5细胞中BSG蛋白表达变化。

结果 与对照组相比，给予外源性Apo D组黑质区神经元和MES23.5细胞的BSG蛋白表达水平均明显上升（t=2.299、3.408，P<0.05）。

结论 外源性Apo D能够促进多巴胺能神经元BSG蛋白表达。

［关键词］ 载脂蛋白D类；Basigin；多巴胺能神经元

［中图分类号］ R338.2

［文献标志码］ A

［文章编号］ 2096-5532（2023）06-0832-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.100

［网络出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230807.0914.001;2023-08-07 16：33：58

EFFECT OF APOLIPOPROTEIN D ON THE PROTEIN EXPRESSION OF BASIGIN IN DOPAMINERGIC NEURONS

LUAN Mengyao， YAN Chunling， JIANG Hong

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of apolipoprotein D （Apo D） on the protein expression of Basigin （BSG） in dopaminergic neurons.

MethodsStainless steel tubes were placed in the lateral ventricle of mice， followed by the treatment with exogenous Apo D. Mouse dopaminergic neurons MES23.5 cells were cultured and treated with exogenous Apo D. Western Blotting was used to measure the change in the protein expression of BSG in the substantia nigra and MES23.5 cells.

Results

Compared with the control group， the exogenous Apo D group had a significant increase in the protein expression level of BSG in both neurons in the substantia nigra and MES23.5 cells （t=2.299，3.408;P<0.05）.

ConclusionExogenous Apo D can promote the protein expression of BSG in dopaminergic neurons.

［KEY WORDS］apolipoproteins D; Basigin; dopaminergic neuron

载脂蛋白D（Apo D）于1963年被首次发现，是人类血浆脂蛋白系统的一个独立成分，属于脂肪钙超家族［1］。在人体内多种器官和组织中均检测到Apo D的表达，其广泛表达表明Apo D在体内具有重要作用［2］。在多种神经退行性疾病中发现大脑及脑脊液中Apo D的表达升高［3-4］。在帕金森病病人中，表达升高的Apo D可能是作为一种抗氧化保护剂来应对多巴胺能神经元损伤［4］。在体外模拟阿尔兹海默病和帕金森病的情况下Apo D也能够保护细胞［5］。但Apo D对神经细胞的保护作用具体机制仍不明确。Basigin （BSG）是免疫球蛋白超家族的成员，在体内介导多种物质的识别和转运［6］。在中枢神经系统，BSG高表达于脑毛细血管内皮细胞和大脑的各个亚区［7］。在多种神经退行性疾病中BSG的表达升高［8-9］。2015年有研究发现，BSG能够作为Apo D内化的受体，并影响着Apo D的神经保护作用［10］。但Apo D和BSG的相互作用仍有待进一步研究。本研究旨在探讨外源性Apo D对多巴胺能神经元BSG蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康雄性 C57BL/6小鼠 40 只，10～12 周齡，体质量（26±2）g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。小鼠置于安静环境下饲养，饲养条件：室温（19±2）℃，12 h-12 h昼夜循环光照，可自由饮水、取食。MES23.5细胞系是由小鼠神经母细胞瘤细胞系N18TG2及大鼠胚胎中脑细胞融合而成的多巴胺能神经母细胞瘤细胞。DMEM-F12（1∶1）培养液购于美国Hyclone公司，胎牛血清（FBS）购于以色列Biological Industries公司，青链霉素混合液购于北京索莱宝公司，多聚赖氨酸购于德国Sigma公司，β-Tublin抗体购于美国CST公司，BSG抗体及羊抗兔IgG-HRP购于上海爱必信公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠单侧脑室埋管术 术前小鼠禁食12 h，腹腔注射80 g/L水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后充分暴露颅骨，立体定位仪定位，用三棱针于颅骨表面侧脑室代表区钻透颅骨（立体定位坐标：前囟后0.3 mm，矢状缝右侧1 mm，颅骨表面下2.2 mm）。将长7 mm、外径0.7 mm、内径0.5 mm的不锈钢外套管置入右侧侧脑室，用502胶和牙托粉固定外套管，并置入针芯防止堵塞。术后恢复3 d，分笼饲养，恢复期间每日腹腔注射2万单位青霉素预防感染。术后第4天，实验组小鼠每天侧脑室注射Apo D 80 μg/kg，对照组小鼠每天侧脑室注射等量的生理盐水，持续7 d。

1.2.2 细胞培养 于细胞培养前1 d，用100 mg/L多聚赖氨酸处理细胞培养瓶。将MES23.5细胞从液氮中迅速转移到37 ℃水浴锅中，完全融化后，用培养液轻轻吹打悬浮，然后接种于预先铺有多聚赖氨酸的培养瓶中，置37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养。实验时细胞以1×105/cm2密度接种于6孔板，实验组细胞给予8 nmol/L Apo D处理24 h，对照组细胞给予等量PBS处理24 h。给药剂量参考相关文献［11］。

1.2.3 Western Blotting检测BSG蛋白表达 侧脑室注射Apo D 7 d后，处死小鼠，根据小鼠脑图谱定位取出黑质区脑组织，置于1.5 mL EP管中，加入100 μL裂解液，置于高速低溫组织研磨仪中研磨，研磨完置于冰上裂解30 min后提取蛋白，然后加入5×loading buffer，在水中煮沸10 min变性。从培养箱中取出MES23.5细胞，负压吸除培养液，每孔加入100 μL裂解液，置于冰上裂解30 min后提取蛋白，然后加入5×loading buffer，在水中煮沸10 min变性。蛋白提取完毕后进行SDS-PAGE凝胶电泳，凝胶孔上样量为每孔20 μg。采用90 V稳定电压进行电泳，300 mA稳定电流进行转膜，转膜时间90 min，转膜结束后根据所需蛋白分子量对PVDF膜进行裁剪，应用10 g/L的脱脂奶粉封闭90 min，分别加入BSG抗体、β-Tublin抗体并置于4 ℃孵育过夜。应用TBST溶液清洗3次，每次10 min，然后加入二抗室温孵育60 min，再用TBST溶液清洗3次，每次10 min。用配制好的ECL化学发光液进行显影并拍照，使用Image J软件分析条

带灰度值。BSG的表达水平以BSG/β-Tublin比值

表示。

1.3 统计学方法

使用GraphPad Prism软件对数据进行统计学分析，计量资料数据以±s表示，两独立样本比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结  果

2.1 外源性Apo D对小鼠黑质区BSG表达的影响

Western Blotting检测结果显示，与对照组小鼠（0.606 9±0.095 2）相比，给予Apo D组小鼠（0.948 4±0.312 6）黑质区BSG蛋白的表达水平明显上升，差异具有统计学意义（n=3，t=3.408，P<0.05）。见图1。

2.2 外源性Apo D对MES23.5细胞BSG蛋白表达的影响

Western Blotting检测结果显示，与对照组细胞（0.836 9±0.059 4）相比，给予Apo D组细胞（1.051 0±0.071 5）BSG蛋白的表达水平明显上升，差异具有统计学意义（n=6，t=2.299，P<0.05）。见图2。

3 讨  论

作为一种在体内广泛分布的蛋白质，Apo D已被发现能与包括胆固醇、孕酮、卟啉、花生四烯酸在内的多个疏水性分子结合，配体的多样性表明Apo D具有广泛的细胞功能。在阿尔兹海默病、卒中、帕金森病、精神分裂等多种疾病中均发现Apo D的表达增加［3-4，12］。在神经系统中Apo D可能参与了胆固醇及其他类固醇的酯化作用［13］。越来越多的证据表明，Apo D具有神经保护作用，过表达Apo D能够防止红藻氨酸诱导的小鼠神经毒性［14］，在小鼠

大脑中过表达Apo D能够提高小鼠存活率并降低氧化应激导致的脑脂质过氧化物增加［15］。多巴胺能神经元作为黑质中最主要的神经元，在动物活动中起很大作用。前期研究已经证明Apo D对多巴胺能神经元具有保护作用［16］，但其作用的具体机制仍不明确。有研究认为，Apo D是通过内化到神经元中调节脂质代谢来发挥保护作用的［14］。

Apo D作为神经系统中具有重要保护作用的物质，其内化的具体机制目前仍不明确。在所有脊椎动物中均检测到BSG基因的表达，其编码产物在体内发挥着物质转运、分子识别等多种功能［17-18］。研究认为，Apo D是通过BSG内化到细胞内的，而且BSG的天然配体亲环素A能够抑制Apo D的内化［10］。离开神经系统的Apo D聚集在肾脏、肝脏等器官中，而其在这些器官中的聚集也与BSG的表达密切相关［19-20］。本研究结果显示，多巴胺能神经母细胞瘤MES23.5细胞给予外源性Apo D处理后，其BSG蛋白表达明显升高，在小鼠黑质区多巴胺能神经元中也得到了相同的结果，这表明在体内和体外Apo D均能够促进多巴胺能神经元BSG蛋白的表达。本研究为进一步揭示Apo D的神经保护作用机制提供了新的思路。

［参考文献］

［1］AYRAULT JARRIER M， LEVY G， POLONOVSKI J. Study of humanserum alpha-lipoproteins by immunoelectrophoresis［J］. Bulletin De La Societe De Chimie Biologique， 1963，45：703-713.

［2］RASSART E， DESMARAIS F， NAJYB O， et al. Apolipoprotein D［J］. Gene， 2020，756：144874.

［3］DESAI P P， IKONOMOVIC M D， ABRAHAMSON E E， et al. Apolipoprotein D is a component of compact but not diffuse amyloid-beta plaques in Alzheimers disease temporal cortex［J］. Neurobiology of Disease， 2005，20（2）：574-582.

［4］ORDOEZ C， NAVARRO A， PEREZ C， et al. Apolipoprotein D expression in substantia nigra of Parkinson disease［J］. Histology and Histopathology， 2006，21（4）：361-366.

［5］MUFFAT J， WALKER D W， BENZER S. Human ApoD， an apolipoprotein up-regulated in neurodegenerative diseases， extends lifespan and increases stress resistance in Drosophila［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008，105（19）：7088-7093.

［6］MURAMATSU T. Basigin （CD147）， a multifunctional transmembrane glycoprotein with various binding partners［J］. Journal of Biochemistry， 2016，159（5）：481-490.

［7］FAN Q W， YUASA S， KUNO N， et al. Expression of basigin， a member of the immunoglobulin superfamily， in the mouse central nervous system［J］. Neuroscience Research， 1998，30（1）：53-63.

［8］ZHU W， KHACHI S， HAO Q， et al. Upregulation of EMMPRIN after permanent focal cerebral ischemia［J］. Neuroche-

mistry International， 2008，52（6）：1086-1091.

［9］TIAN L， ZHANG Y， CHEN Y， et al. EMMPRIN is an independent negative prognostic factor for patients with astrocytic glioma［J］. PLoS One， 2013，8（3）：e58069.

［10］NAJYB O， BRISSETTE L， RASSART E. Apolipoprotein D internalization is a basigin-dependent mechanism［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2015，290（26）：16077-16087.

［11］戴瑩莹，阎春玲，毕明霞，等. 载脂蛋白D对多巴胺能神经元的保护作用［J］. 青岛大学学报（医学版）， 2020，56（2）：140-142.

［12］THOMAS E A， DEAN B， PAVEY G， et al. Increased CNS levels of apolipoprotein D in schizophrenic and bipolar subjects： implications for the pathophysiology of psychiatric disorders［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2001，98（7）：4066-4071.

［13］EL-DARZI N， MAST N， PETROV A M， et al. Studies of ApoD-/- and ApoD-/-ApoE-/- mice uncover the APOD significance for retinal metabolism， function， and status of chorioretinal blood vessels［J］. Cellular and Molecular Life Sciences， 2021，78（3）：963-983.

［14］NAJYB O， CARMO S D， ALIKASHANI A， et al. Apolipoprotein D overexpression protects against kainate-induced neurotoxicity in mice［J］. Molecular Neurobiology， 2017，54（6）：3948-3963.

［15］GANFORNINA M D， CARMO S D， LORA J M， et al. Apolipoprotein D is involved in the mechanisms regulating protection from oxidative stress［J］. Aging Cell， 2008，7（4）：506-515.

［16］BAJO-GRAERAS R， GANFORNINA M D， MARTN-TEJEDOR E， et al. Apolipoprotein D mediates autocrine protection of astrocytes and controls their reactivity level， contributing to the functional maintenance of paraquat-challenged dopaminergic systems［J］. Glia， 2011，59（10）：1551-1566.

［17］WANG N， JIANG X， ZHANG S， et al. Structural basis of human monocarboxylate transporter 1 inhibition by anti-cancer drug candidates［J］. Cell， 2021，184（2）：370-383.e13.

［18］WANG K， HUANG W， CHEN R， et al. Di-methylation of CD147-K234 promotes the progression of NSCLC by enhancing lactate export［J］. Cell Metabolism， 2023，35（6）：1084.

［19］DESMARAIS F， BERGERON K F， RASSART E， et al. Apolipoprotein D overexpression alters hepatic prostaglandin and omega fatty acid metabolism during the development of a non-inflammatory hepatic steatosis［J］. Biochimica et Biophysica Acta Molecular and Cell Biology of Lipids， 2019，1864（4）：522-531.

［20］DESMARAIS F， HERV V， BERGERON K F， et al. Cerebral apolipoprotein D exits the brain and accumulates in peripheral tissues［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2021，22（8）：4118.

（本文編辑 马伟平）