结核分枝杆菌Rv3872与Rv3873基因的克隆及重组真核表达载体的构建

李双双+李木楠+关松磊+张文慧+张林波

摘 要：目的：克隆结核分枝杆菌Rv3872与Rv3873基因，并构建Rv3872与Rv3873基因的重组真核表达载体，为研究这2个基因的功能奠定实验基础。方法：利用PCR技术克隆Rv3872与Rv3873基因序列，将其连接至pMD-18T载体，鉴定成功后将Rv3872与Rv3873序列插入真核表达载体pEGFP-C1，构建重组pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体，并进行质粒PCR、双酶切以及测序验证。结果：经测序比对后，Rv3872与Rv3873序列与GeneBank中公布的基因序列一致，重组载体构建成功。结论：成功构建重组pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体。

关键词：结核分枝杆菌；Rv3872；Rv3873；真核载体

中图分类号 R446 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）08-0012-04

Abstract：Objective：Cloning of Mycobacterium tuberculosis Rv3872 and Rv3873 gene and constructing recombinant eukaryotic expression vector of Rv3872 and Rv3873 gene.Methods：The whole gene of Rv3872 and Rv3873 sequence were cloned by PCR，and then the gene were inserted into the pMD-18T，then inserted it into the pEGFP-C1 after successful validation，constructing the recombinant eukaryotic expression vectors of pEGFP-C1-Rv3872 and pEGFP-C1-Rv3873，and then the plasmid was validated by PCR and double enzyme digestion and sequencing.Resluts：Rv3872 and Rv3873 were consistent with the gene sequences published in GeneBank after sequencing，and the recombinant vector was successfully constructed.Conclusion：The recombinant eukaryotic expression vectors pEGFP-C1-Rv3872 and pEGFP-C1-Rv3873 were successfully constructed.

Key words：Mycobacterium tuberculosis；Rv3872；Rv3873；Eukaryotic vector

結核病（Tuberculosis）是一种因感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）而引发的人畜共患传染性疾病。2015年全世界新发结核病数量约为1 040万例，据估计有140万人死于结核病，还有40万艾滋病毒感染者死于结核病[1]。结核分枝杆菌侵入机体后，主要由肺泡巨噬细胞吞噬、消化和摧毁，但结核分枝杆菌仍可以在这种恶劣的环境下生存和复制，其根本原因在于MTB可以调控宿主免疫、干扰细胞凋亡机制，抵御机体对病原菌的清除，进而在体内复制和传播。通过DNA微阵列分析发现，弱毒性结核分枝杆菌与致病性结核分枝杆菌相比存在11个差异区（region of difference，RDs），与牛结核分枝杆菌相比存在16个RD区。RD1区是近年来人们研究的热点，由RD1区分泌的蛋白有望成为结核病潜在的候选疫苗及诊断工具。Rv3872和Rv3873分别是PE和PPE家族成员，研究表明Rv3872与Rv3873编码的PE35蛋白与PPE68蛋白在结核杆菌与巨噬细胞作用过程中发挥重要作用，能够影响宿主细胞的功能[2，3]，但目前的研究尚不能完全阐述作用机制。本研究通过分子生物学手段，克隆Rv3872与Rv3873基因并构建重组真核表达载体，为下一步研究Rv3872和Rv3873在胞内的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒和主要试剂 真核表达载体pEGFP-C1载体由厦门大学馈赠。限制性内切酶KpnI、BamHI、E×Taq酶、T4 DNA ligase、10 X T4 DNA Ligase buffer、DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker（TaKaRa）；质粒提取试剂盒（Gene Mark）；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 （Axygen公司）、PCR产物纯化试剂盒（Sangon Bitech）、pMD-18T载体（TaKaRa）。

1.2 方法

1.2.1 Rv3872、Rv3873基因的PCR扩增 根据Genbank中公布的Rv3872、Rv3873基因序列用Prime5.0进行引物设计，引物序列分别为P1 ：5′-ATGACAGAGCAGCAGTGGA-3′、P2：5′-CTATGCGAACATCCCAGT-3′、P3：5′-ATGCTGTGGACAGCAA-3′、P4：5′-ATGCTGTGGACAGCAA-3′，设计完成后送至上海生工生物工程有限公司合成。以人型H37Rv全基因组为模板，以P1与P2、P3与P4为引物扩增Rv3872、Rv3873基因，退火温度为63.5℃、69℃，扩增体系为P1/P2、P3/P4各1μL，ExTaq mix 12.5μL，H37Rv全基因组1μL，ddH2O 9.5μL，PCR反应参数为：95℃预变性3min，95℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃再延伸l0min，4℃保温l0min。反应结束后，制备1%琼脂糖凝胶，130V，电泳25min。

1.2.2 重组pMD-18T-Rv3872、pMD-18T-Rv3873载体的构建及验证 使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，将回收的PCR产物与pMD-18T连接，连接体系为T4 DNA ligase（350U/μL）1μL、10XT4 DNA Ligase buffer 1μL、pMD-18T3μL、回收目的基因5μL，金屬浴16℃过夜连接，16h。将重组质粒转化E.coli DH5a，转化后将菌液涂布与含有氨苄抗性的LB固培养基，37℃培养过夜，挑取阳性单菌落置于含氨苄抗生素的LB液体培养基内，振荡过夜。提取重组质粒，并进行重组质粒PCR及双酶切验证，验证成功后送至上海生工测序。

1.2.3 重组pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体的构建及鉴定 根据pEGFP-C1的载体图谱，在目的基因上下游引物的5′端引入KpnⅠ和BamHⅠ，并加入与之相对应的保护性碱基，具体引物序列设计为：P5：5′-CGGGGTACCATGGAAAAAATGTCACA-3′、P6：5′-CGCGGATCCCTATTCGGCGAAGACG、P7：5′-CGGGGTACCATGCTGTGGACAGCAA-3′、P8：5′-CGCGGATCCTCACCAGTCGTCCTCTTCG-3′，以测序成功的pMD-18T重组质粒为模板，用带酶切位点的引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体系和反应条件同前，分别以P5与P6、P7与P8为引物扩增Rv3872和Rv3873基因，反应完成后，用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对目的条带产物进行回收。对回收纯化的PCR产物与pEGFP-C1载体分别用KpnI、BamHI双酶切，纯化回收。纯化回收的基因与载体酶切产物连接，连接体系为T4 DNA ligase（350U/μL） 1μL、10XT4 DNA Ligase buffer 1μL、pEGFP-C1 3μL、回收目的基因5μL，金属浴16℃过夜连接，16h。将重组质粒转化E.coli DH5a，转化后将菌液涂布与含有氨苄抗性的LB固培养基，37℃培养过夜，挑取阳性单菌落置于含氨苄抗生素的LB液体培养基内，振荡过夜。提取重组质粒，并进行重组质粒PCR及双酶切验证，验证成功后送至上海生工测序。

2 结果与分析

2.1 Rv3872、Rv3873基因的PCR扩增结果 经PCR扩增得到Rv3872、Rv3873基因，其片段长度分别为300bp、1 107bp左右，目的基因产物条带清晰，条带位置与预期位置相一致（图1、2）。

2.2 重组pMD-18T-Rv3872、pMD-18T-Rv3873载体的构建及验证结果 对构建的重组pMD-18T-Rv3872、pMD-18T-Rv3873载体进行质粒PCR验证和双酶切验证，结果表明质粒PCR成功获得长度分别为300bp、1107bp左右的片段，双酶切产物有两个条带，与预期结果一致（图3、4、5、6）。

2.3 重组pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体的鉴定 利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，将重组质粒用KpnⅠ和BamHⅠ进行质粒PCR及双酶切验证，发现与目的基因大小相一致，且条带单一无杂带，重组真核表达载体验证成功后将其送至上海生工进行测序。对测序结果与Genbank中Rv3872、Rv3873公布的序列进行对比，经DNAMAN Version5.2.2分析显示，二者氨基酸序列同源性均为100%，说明重组pEGFP-C1-Rv3872、pEGFP-C1-Rv3873和pEGFP-C1-Rv3878真核表达载体构建成功（图7、8、9、10）。

3 讨论

作为结核病的病原体，结核杆菌H37Rv全基因组共4 411 529bp，包括4 047个基因，其中4 018个为蛋白编码基因[4]。MTB蛋白广泛参与宿主细胞周期调控、各种代谢途径、细胞运动与胞内运输、RNA加工与转录后修饰、防御机制与信号转导机制、影响细胞结构以及逃逸宿主免疫杀伤，此外还有一些未知的功能有待进一步研究[5，6]。

PE/PPE蛋白家族有多个成员涉及宿主免疫逃避[7-9]。其中PE35和PPE68分泌或与分枝杆菌细胞膜相关，参与介导宿主与病原体之间的相互作用[10，11]。有研究证明PE35和PPE68与分枝杆菌感染的细胞免疫应答相关[12，13]。PE35和PPE68依赖TLR2受体诱导THP-1巨噬细胞分泌IL-10和MCP-1并且降低IL-12p70的分泌，抵御宿主的清除[14-16]。pEGFP-C1载体为目前常用的真核细胞表达载体，含有PUC和SV40双启动子以及多克隆位点，保证外源基因能够在大肠杆菌与哺乳动物细胞内复制。pEGFP-C1载体上含有EGFP绿色荧光蛋白，其为GFP的突变体，其荧光强度为GFP的35倍，有利于外源基因在细胞内的定位标记[17]。

作为MTB潜在的毒力因子，MTB感染宿主细胞后，PE35与PPE68胞内具体如何作用，目前尚不明确。为研究PE35与PPE68在宿主内的作用方式，本实验通过基因工程技术构建pEGFP-C1-Rv3872、pEGFP-C1-Rv3873重组真核表达载体，经质粒PCR及质粒双酶切验证，DNA测序比对，与GenBank上公布的基因序列完全相同，载体构建成功，为进一步研究PE35、PPE68与宿主细胞的作用机制奠定基础。

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