蛹虫草菌株退化机制研究进展

余碧霞，哈满林，李 萍，金季也

（安庆职业技术学院农林与服装学院，安庆 246003）

蛹虫草（Cordyceps militaris）属麦角菌科虫草属，又名北冬虫夏草，是虫草属的模式种，2019年入选《中华人民共和国农业植物品种保护名录》（第十一批），含有虫草素、虫草多糖等多种活性成分，在抗肿瘤、增强免疫力等方面具有很好的药理作用[1-5]。蛹虫草现已列为易危菌类，可通过人工栽培解决野生资源严重不足的情况。但在蛹虫草栽培时，易发生菌株退化现象。从野外采集的菌株经3～5代传代，菌种保藏时不适宜的温度、光照、氧气环境条件，培养基中不适宜的营养元素，菌株交配型的改变与基因变异等均会导致菌种退化，表现为菌丝生长速度慢、菌丝活力低、子实体产量下降、畸形或不产生子实体、有效活性成分降低等[6-7]。菌株退化具有可遗传性，给生产带来极大风险。研究蛹虫草菌株退化的表型特征与退化机制，为生产甄别退化菌株与菌株复壮提供理论依据[8]。

1 菌株退化的表型特征

1.1 形态特征

蛹虫草属丝状真菌，经多次继代培养发生菌株退化。固体培养时，菌落出现扇形、半月形和放射形局变现象，气生菌丝旺盛，菌丝颜色变浅，产孢数量减少，菌株生长的节律环不明显[9]；液体培养时，菌株培养液浑浊，菌丝球之间黏连，单个菌丝球不明显，呈粥糊状[10]。有的发生菌丝自溶现象，分生孢子聚集在一起呈头状，显微镜下观察，发现菌丝分枝多，呈纤细弯曲的不规则状，皱缩菌丝数量增加，退化程度加重[11]。子实体形成阶段，见光转色慢或不转色，产量下降，形态纤细，没有子囊壳，或只形成类似子实体原基的菌丝体[12-13]。

1.2 生理生化特征

蛹虫草退化菌株生长速率早期逐渐降低，第18天左右开始加快，细胞内小液泡增多增大，细胞壁皱缩变形、缢裂，细胞核数量减少，线粒体分布密集、体积变小，膜边体减少，圆球体溶解，形成脂滴和嗜锇颗粒[14-15]。退化菌株体内类胡萝卜素、纤维素酶、淀粉酶、胞外多糖、虫草多糖、腺苷、脂质、虫草素含量降低，麦角甾醇含量与转代次数呈负相关，急骤下降，体内过氧化氢酶（CAT）、单脱氢抗坏血酸酶（MDHAR）、氧化酶（GR）活性降低，而胞内多糖、生长点活性氧含量升高。构巢曲霉的谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）基因在菌株体内过量表达，使菌株具有更高的GPX活性，可增强清除细胞内活性氧的能力[16-18]。退化菌株细胞自噬基因Atg22、Atg22-2、Atg13、Atg18表达量上升，分别为336.06%、61.01%、432.19%、170.45%，培养液中添加合成染料BTB，颜色变成绿色或蓝色，pH升高至6.9～7.9，总糖含量随传代次数增加而下降，总蛋白含量呈先下降再升高的趋势[19]。退化菌株体内各成分含量的变化可作为早期检测的标志。

2 菌株退化机制

栽培中，发生菌株退化是多种因素共同作用导致，使菌株表型改变、代谢产物下降。研究发现引起蛹虫草退化的原因主要为环境因素和菌株遗传因素两方面[20-21]。

2.1 环境因素

蛹虫草菌株在全黑暗条件，不适宜的保藏温度、保藏时间均可引起菌株退化。4 ℃低温菌种可保藏1～2个月，10～20 ℃菌种只能保藏1个月。蛹虫草菌种长期保藏时，超低温、缺氧等方式可降低菌丝细胞代谢速率，有效降低菌种退化速率，但长期低氧环境下，菌株发生突变的可能性增加[22-23]。长时间光照有利于菌丝转色，细胞内活性氧含量随之增高，活性氧含量过量积累是导致蛹虫草菌株退化的重要因素[24-25]。

培养基中一定浓度K+、Ca2+、Zn2+能延缓菌株退化，而Mn2+、Mg2+加速菌株退化[26]。蔗糖或葡萄糖小分子碳源，对菌丝体生长有一定促进作用，利于菌丝细胞吸收养分，提高菌丝质量和子实体产量，淀粉作为碳源时菌丝状态和生长速度最差；蛋白胨、蛋清液、鱼粉作为氮源时易被菌丝吸收，是最佳的氮源。一定浓度的Cr3+增加菌丝协迫作用，但可提高菌株子实体生物量和有效活性成分[27-29]。

2.2 遗传因素

2.2.1 交配型基因缺失 蛹虫草是典型二极性异宗配合子囊菌，具有子囊菌交配型位点同位异源结构，即同一位点存在两类不同交配型基因。蛹虫草有性生殖受交配型基因控制，不同交配型基因的菌株通过亲和性交配形成双核菌丝，再形成子实体[30-31]。含有MAT-HMG（MAT1-2-1）和MAT-alpha（MAT1-1-1、MAT1-1-2）两种交配型基因是异核体菌株，可进行有性生殖，栽培可形成子实体；只含有MAT-HMG（MAT1-2-1）或MAT-alpha（MAT1-1-1、MAT1-1-2）两种交配型基因中一种的是同核体菌株，栽培不形成子实体。可见交配型基因的缺失是蛹虫草退化的主要因素之一。

2.2.2 碱基突变 蛹虫草菌株传代次数增加，碱基发生变异的可能性增大，菌株传代到第5代时，比原始菌株ITS序列不同位点发生2～3处碱基突变[32]。对蛹虫草的ITS 5.8S、18S、28S区域进行检测，ITS+5.8S+ITS2、28S区域没有发生变化，退化菌株在18S区域7处碱基发生突变，在5.8S+ITS区域，退化菌株在第279和360个碱基处发生T到C转换[33]。利用PCR-RFLP（限制性片段长度多态性聚合酶链反应）和RAPD（随机扩增多态性DNA标记）技术发现，蛹虫草退化菌株在DNA水平上突变频率高于正常菌株，限制性XspI内切酶在退化菌株上没有酶切位点，这可能与蛹虫草菌株退化相关。

2.2.3 基因差异 全基因组测序分析发现，蛹虫草菌株体内有多种光受体基因，敲除蓝光受体基因Cmwc-1时，菌株在光照下不发生变色，影响原基和子实体形成，类胡萝卜素及虫草素合成受阻，分生孢子数量降低[34-35]。而Cmcry-dash缺失会降低Cmwc-1基因表达[36]。一些光受体基因是菌株退化的可能因素。

蛹虫草单分生孢子菌株进行连续继代培养，对第1代、第3代和第5代菌株形成的原基进行转录组测序，共检测到10 901个基因，发现3 229个差异表达基因（DEGs）。第5代与第3代相比，DEGs的数目总和为2 099；第3代与第1代相比，DEGs的数目总和为656，说明分生孢子传代到第3代是菌株退化的开始，且随着传代次数增加，DEGs数量不断增多。对3 229个DEGs进行GO富集分析，发现DEGs在生物过程中的GO富集主要表现在跨膜转运过程，毒素、霉菌、次生代谢产物的生物合成过程和代谢过程，表明菌株退化与这些生物的合成与代谢过程有关。对DEGs进行KEGG富集分析，发现第5代与第1代相比的2 366个DEGs与第5代与第3代相比的2 099个DEGs有相似的富集通路：酪氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、谷胱甘肽代谢、苯丙氨酸代谢，表明这些代谢通路可能与菌株退化有关。

DNA甲基化蛋白使退化菌株与正常菌株产生基因表达差异，退化菌株中CmDim-2、CmHh3、CmHmd、CmM16、CmLsd、CmHn和CmMfl7个甲基化基因表达量显著升高，而CmHln、CmDmta和CmSam基因表达量显著降低，通过基因敲除试验发现，甲基化相关基因参与蛹虫草的菌株生长速度、分生孢子产量、孢子萌发速率和菌丝尖端生长，与交配型基因在菌株退化过程中起协同作用[37]。

3 预防菌株退化的措施

3.1 适宜的环境条件

低温黑暗是蛹虫草菌种长期保藏的主要环境。菌种短期保藏，昼夜5～10 ℃变温、一定量的散射光可较好保持菌种性能，菌丝生长健壮、具有整齐的菌落边缘、生长速度快、角变面积小、转色快、子实体品质优良，较4 ℃恒温黑暗保藏效果好。菌种保藏时间超过30 d，菌种质量显著下降。菌种保藏时间超过1年，4 ℃低温黑暗保藏效果较好。在培养基中添加0.5%琼脂对防止水分蒸发有一定作用，密封口用无菌胶塞代替棉塞，可有效防止杂菌种污染[38]。

3.2 适宜的培养条件

在蛹虫草培养基中添加1.5%的组氨酸和0.64%的赖氨酸明显降低菌丝色素退化[39]。分别添加1.0 g·L-1K+、0.02 g·L-1Ca2+、250 μg·L-1或375 μg·L-1Zn2+能延缓菌落退化。蔗糖或葡萄糖等小分子碳源，蛋白胨、蛋清液等有机氮源，蚕蛹粉等复合氮源，一定浓度IAA等植物生长激素，维生素C，粉色光均有利于菌丝生长，可提升虫草素的活性成分含量，提高菌种品质。

3.3 减少传代次数

研究发现蛹虫草菌种在传代培养时，第3代开始出现退化现象，传代次数越多，菌种发生变异和退化的可能性越大，生产中尽量减少传代次数。用液体菌种替代固体菌种，可延迟菌种退化发生的时间。

4 菌株复壮技术

4.1 组织分离法

选择生长期10～20 d性状优良、颜色纯正具有品种特性的优质子实体，或野外采集的子实体，75%酒精消毒，无菌水冲洗5次，吸干水分，在无菌操作台上挑取上部菌体1 mm×1 mm接种于斜面培养基，22～25 ℃培养箱内培养15 d，待菌丝布满斜面，接种到大米栽培培养基进行子实体培养，人工选择得到优良菌株[40]。

4.2 单孢分离杂交法

将无菌培养获得的优良成熟子实体，在三角瓶上方固定，待孢子散落在三角瓶中，收集子囊孢子，采用稀释涂布平板法获得单孢菌落，以交配型为标记，选择含有MAT1-1和MAT1-2的分生孢子和子囊孢子进行杂交，将获得的杂交菌株进行子实体培养，筛选获得优良菌株[41]。

4.3 虫体回接法

将退化的菌种接种到液体培养基中获得菌悬液，用医用注射器取0.2～0.4 mL菌悬液注射到70%～75%酒精消毒的活柞蚕蛹体内，置于消毒瓶中16～18 ℃培养约50 d，待子实体长出，采用组织分离法挑取菌丝体接种到PDA培养基上，培养筛选得到优良菌株。

4.4 物质添加法

将退化菌株接种到含有0.1 mg·mL-1氨苄青霉素，或0.2 mg·mL-1卡那霉素，或0.025 mg·mL-1小诺霉素+头孢霉素IV的培养基中进行第一次复壮培养3 d，再分别接种到含有添加0.3 mg·mL-1氨苄青霉素，或1 mg·mL-1链霉素，或1 mg·mL-1卡那霉素+0.3 mg·mL-1氨苄青霉素的培养基上进行第二次复壮培养3 d，转接到PDA培养上培养，菌株菌丝生长速度大幅提高，菌丝体粗壮、致密，子实体产量大幅提高[42]。在100 mL MM培养基中添加9.375 g真姬菇菌渣（菌渣采用53.125 g大米、42%玉米芯、25%杂木屑、12%米糠、15%麸皮、6%玉米粉培养真姬菇），进行菌株培养，菌丝中虫草素、腺苷含量增加，子实体产量提高[43]。

4.5 原生质体诱变融合法

虫草属真菌，利用原生质体融合和诱变技术，打破种属不亲和现象，实现基因交换与重组，产生新的基因型。蛹虫草育种时采用父本或母本灭活与正常活性原生质体融合，或父母本均采用药物、紫外线诱变等灭活，融合子受损位点互补而具有活力，原生质体融合后，25 ℃培养再生菌落，待菌丝体长满进行优良融合子筛选，获得性状稳定的优良菌株[44-45]。

5 结 论

蛹虫草菌株发生退化时，其形态特征和生理生化特征会发生明显改变，可通过直接观测菌落形态，显微镜观测菌丝结构、分生孢子形态，利用TTC-脱氢酶还原法[46]、溴麝香草酚蓝指示剂法[47]、HPLC法、总糖含量测定（GB/T 15672-2009）、考马斯亮蓝G250法[19]、氮蓝四唑NBT检测法[48]测定脱氢酶活性、退化菌株的培养基颜色、虫草素含量、培养基中总糖、培养基中总蛋白含量、菌丝活性氧含量，采用PCR扩增测序[17]、q RT-PCR检测差异基因表达[19]，为生产中甄别退化菌株提供理论依据。

仅筛选退化菌株不能促进产业发展，需要采用适宜保藏条件、培养条件等延缓菌种退化时间，还需采用适宜的菌株复壮技术进行菌株复壮，降低生产风险，目前采用的菌株复壮方法主要包括组织分离法、单孢分离杂交育种法、虫体回接法、培养基中添加抗生素等物质、原生质体诱变融合等。

目前对蛹虫草菌株退化的研究主要包括环境因素及菌株本身的遗传特性两方面，其中遗传因素是起主导作用的因素。了解菌株退化机制，才能有效解决菌株退化问题，蛹虫草菌种退化的研究方向包括探明退化相关基因的调控通路与有效成分合成途径、差异表达基因的功能、基因工程改造技术等。