乳粉中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）能力验证PCR技术的探索

仇平平　田梦　孙巧巧

摘 要：为提高实验室检测克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的能力，本文依据NIFDC-PT-384乳粉中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验能力验证作业指导书、GB 4789.40-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验 》，探索传统生化方法和PCR技术相结合的检测克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的方法。结果表明，样品CODE12未检出克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），样品CODE19检出克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），结果均为满意。本实验室具备检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的能力，PCR技术很好地印证了传统生化实验的结果。

关键词：乳粉，克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），能力验证，PCR技术

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.16.028

0 引言

克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）是肠杆菌科内一类短杆状革兰氏阴性菌，1980 年以前被称为“产黄色素阴沟肠杆菌（yellow-pig mented Enterobacter cloacae）”，1980 年更名为阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii），2008年被重新定义为一个新属，即克罗诺杆菌属[1-2]。国家食品安全标准GB4789.40-2016也做了相应调整，由“阪崎肠杆菌”更名为“克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）”。阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种条件致病菌，主要传播媒介是奶粉，6月龄以下婴儿是克罗诺杆菌属的易感人群。婴儿感染该菌后会引起菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎等，致死率高达40%-80%[3-5]。针对婴幼儿食品的安全要求，国家食品安全标准GB 29921-2021《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》中明确规定，婴儿（0～6月龄）配方食品、特殊医学用途婴儿配方食品中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）不得检出。

近些年，克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的检测技术也在快速发展，其中以PCR检测技术发展最快[ 7- 8 ]。目前，克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）的检测主要是以传统生化培养法为主，如何将PCR技术和传统生化培养法结合起来应用到日常工作中是本实验设计PCR实验的出发点。参照SN/T 1632.2-2013《出口奶粉中克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验方法 第2部分：PCR方法》合成阪崎肠杆菌特異性引物SAFA-F、SAFA-R，参照《中国药典》2020年版四部1021合成16SrRNA通用引物16SV1F、16SV3R，进行PCR扩增，查看凝胶电泳结果，将PCR产物送至第三方机构测序，测序结果在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，简称NCBI）数据库比对寻找同源微生物，与传统生化培养法结果比较，以期可以将PCR技术和传统生化培养方法有效结合起来，保证检测结果的准确可靠。

1 材料

1.1 样品

样品由中国食品药品检定研究院提供，2份待测样品，每份样品包含装有菌球的西林瓶1瓶和相同编码的乳粉1袋（规格：100克/袋），2份样品分别编号为：CODE12和CODE19。

1.2 培养基及试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（mLST）基础及配套添加试剂万古霉素、阪崎肠杆菌显色培养基（DFI琼脂）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）干制生化鉴定试剂盒、氧化酶试纸及试剂、DNA提取裂解液，以上均采购于北京陆桥技术股份有限公司。

引物SAFA-F：GGGTTGTCTGCGAA GCGAA，SAFA-R：GTCTTGTGCTG CGAGTTTG；引物16SV1F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物16SV3R：GTATTACCGCGGCTGCTGGC（均由金唯智生物科技有限公司合成）。Premix Taq（TaKaRaTaqTM Version 2.0 plus dye）（品牌：TaKaRa），DL1000 DNA Marker（品牌：TaKaRa），琼脂糖（品牌：IOWESTR），5×TBE缓冲液（品牌：SolarbioR），GelRedR Nucleic Acid Gel Stain核酸染色剂（品牌：BIOTIUM）。

1.3 仪器设备

无菌均质器（上海德记行科技发展公司）、DHP-9162B电热恒温培养箱（上海一恒仪器）、SPL -2 50生化培养箱（天津市莱波特瑞仪器）、VITEK2全自动微生物分析系统（梅里埃）、H1650R台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器）、SVCJ-2G型双人单面净化工作台（苏州净化设备）、T100定性PCR仪（品牌：伯乐BIO-RAD）、Powerpac Universa l通用电泳仪（品牌：伯乐BIO-RAD）、GelDoc EZ凝胶成像分析系统（品牌：伯乐BIORAD）。

1.4 标准菌株

阪崎肠杆菌 ATCC29544。

2 实验方法

2.1 样品处理

在生物安全柜内打开样品菌球的西林瓶，将西林瓶内的小球加入到盛有900 mL灭菌缓冲蛋白胨水（BPW）的无菌均质袋中，充分溶解。然后再将与西林瓶相同编码的乳粉样品加入到上述缓冲蛋白胨水（BPW）中，充分混匀，作为样品匀液。以阪崎肠杆菌标准菌株为阳性对照。

2.2 前增菌、增菌和PCR实验

2.2.1 前增菌

将上述样品匀液置于电热恒温培养箱中36 ℃培养18 h。

2.2.2 增菌

移取上述培养物1 mL转种于10 mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（mLST-Vm）肉汤中，混匀，44 ℃培养24 h。

2.2.3 菌液提取DNA模板进行PCR实验

（1）菌液提取DNA。取前增菌液1 mL于1.5 mL离心管中，3000×g离心10 min，弃去上清，加入200 μL裂解液，涡旋混匀，沸水浴裂解10 min，冷却后12000×g离心2 min，取上清即为模板。

（2）特异性引物PCR扩增。反应体系Premix Taq（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye） 25 μL，DNA模板2 μL，引物SAKA-F和引物SAKA-R（10 μmol/L）各1 μL，加无菌无酶水至总体积50 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

（3）凝胶电泳。用电泳缓冲液1×TA E制备1%琼脂糖凝胶（冷却至50 ℃左右加入GelRedR Nucleic Acid Gel Stain核酸染色剂），取PCR产物点样，用DL1000DNA Marker做参照。3 V/cm～5 V/cm恒压电泳，电泳30 min～60 min，用凝胶成像分析系统观察并记录结果。

（4）测序。将扩增出目标条带的PCR产物送至金唯智生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI网上数据库进行比对。

2.3 分离

上述mLST-Vm肉汤培养物，轻摇混匀，用接种环取1环，划线接种于阪崎显色培养基平板上，平行划线接种两个平板，36 ℃，培养24 h。

挑取5个可疑菌落，划线接种于TSA平板上，25 ℃，培养48 h。

2.4 鉴定

挑取TSA平板上黄色可疑菌落，选用商品化的生化鉴定试剂和梅里埃VIKE2全自动微生物分析系统上机鉴定进行生化鉴定。

菌落提取DNA模板：用接种环取一环纯化后的菌落，溶于200 μL裂解液中，涡旋混匀，沸水浴裂解10 min，冷却后12000×g离心2 min，取上清即为模板。

16 S通用引物PCR 扩增：反应体系Premix Taq（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye）25 μL，DNA模板2 μL，引物16S1VF和引物16SV3R（10μmol/L）各1 μL，加无酶无菌水至总体积50 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，進行30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。凝胶电泳和测序同2.2.3。

3 结果与分析

3.1 生化鉴定结果

采用商品化生化鉴定试剂盒和梅里埃VIKE2全自动微生物分析系统进行鉴定，本次能力验证CODE12未检出克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），CODE19检出克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），与中检院的标准结果一致，结果满意。

在阪崎肠杆菌显色平板上，克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）呈现蓝-绿色，如图1（a）、（b）、（c）所示，CODE12为无色菌落，CODE19和阳性对照均有蓝-绿色菌落。

在TSA平板上，阪崎肠杆菌可以产生黄色素。结果显示，CODE12在TSA平板上为无色菌落，CODE19蓝-绿色菌落转种后在TSA平板上为黄色菌落，CODE19黑色菌落转种后在TSA平板上为无色菌落，阳性对照在TSA平板上为黄色菌落。

克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）干制生化鉴定试剂盒鉴定结果显示，CODE12无色菌落和CODE19黑色菌落不符合阪崎肠杆菌生化反应，CODE19蓝绿色菌落和阳性对照符合阪崎肠杆菌生化反应。结合上述结果可以判定CODE19检出克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），CODE12未检出克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）。

梅里埃VIK E2全自动微生物分析系统上机鉴定结果见表1，CODE12鉴定为大肠埃希菌（Esch.coli），CODE19蓝-绿色菌落（CODE19-1）鉴定为阪崎肠杆菌（Cro. sakazakii），CODE19黑色菌落（CODE19 -2）鉴定为奇异变形杆菌（Proteusmirabilis）。

3.2 PCR扩增结果

本实验从两个角度设计PCR实验：第一，从增菌培养物中提取DNA，因有背景菌的干扰，选用阪崎肠杆菌特异性引物SAKA-F、SAKA-R进行PCR扩增目的片段（282 bp左右），如图2所示泳道1-4，泳道1是以CODE12菌液DNA为模板，泳道2是以CODE19菌液DNA为模板，泳道3是以阪崎肠杆菌菌液DNA为模板，泳道4是阴性对照；第二，从纯化后的TSA平板上单菌落提取DNA，选用细菌16SrRNA通用引物16S1VF、16SV3R进行PCR扩增目的片段（500 bp左右），如图2所示泳道6-11，泳道6是以CODE12菌落DNA为模板，泳道7是以CODE19蓝-绿色菌落DNA为模板，泳道8是以CODE19黑色菌落黑色部分DNA为模板，泳道9是以CODE19黑色菌落无色部分DNA为模板，泳道10是以阪崎肠杆菌菌落DNA为模板，泳道11是阴性对照。

将全部有条带扩增出来的PCR产物送至金唯智生物科技有限公司测序，进一步确定微生物种类。

测序结果放到NCBI数据库进行菌株的同源性比对，一致度越高说明与该菌株同源性越接近，见表2，CODE12（编号6）与大肠埃希菌同源性接近，CODE19（编号2和编号7）与克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）同源性接近，结合生化鉴定结果进行判定。

4 讨论

在分离鉴别克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）时，阪崎肠杆菌显色培养基比较关键。阪崎肠杆菌含有α-葡萄糖苷酶，可特异性分解5-溴-4氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡糖甙使菌落呈现蓝-绿色[9]。此次能力验证提供的两份样品，CODE12只有一种无色菌落形态，CODE19不仅有蓝-绿色菌落还有黑色菌落（无色菌落有黑色中心）。识别和排除非目标菌的干扰可以有效考核能力验证参与者的水平。本实验采用传统生化鉴定方法和PCR技术分别对黑色菌落进行了进一步的鉴定，最终鉴定为奇异变形杆菌。

能力验证检品菌落特征一般都比较典型，容易区分不会弄错，但在实际工作中食品样品中菌种未知且复杂，未知菌的确证鉴定也比较烦琐，需要多方验证方知微生物种类，本实验提供的PCR实验思路，可以有效印证传统生化实验的结果。

5 结论

本实验室按照GB 4789.40-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验 》开展试验，CODE12未检出克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），CODE19检出克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌），结论为满意，顺利通过本次能力验证。本次设计的PCR实验达到预期效果，与GB 4789.40-2016结果相吻合。由此可见，PCR技术可以很好地应用到食品克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验中去，两相结合可以提高检验结果的准确性。

参考文献

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作者简介

仇平平，硕士研究生，工程师，研究方向为食品药品微生物检测。

田梦，硕士研究生，工程师，研究方向为食品药品微生物检测。

孙巧巧，本科，主管药师，研究方向为食品药品微生物检测。

（责任编辑：袁文静）