头孢他啶/阿维巴坦、多黏菌素B和替加环素对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性分析

陈怡丽 刘平娟 余广超 伍众文 郭鹏豪 彭雅琴 李雨芯 刘敏 廖康

摘要：目的 評价头孢他啶/阿维巴坦（CAZ-AVI）、多黏菌素B和替加环素对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）的体外抗菌效应研究，指导临床正确选择并合理使用抗菌药物。方法 收集2018—2021年期间从广东地区8家三级综合医院临床分离的对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌172株，采用聚合酶链反应（PCR）以及NG-Test?CARBA5检测菌株的5种常见碳青霉烯酶耐药基因；采用微量肉汤稀释法药敏试验分别检测CAZ-AVI、多黏菌素B和替加环素的单药最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration， MIC）值。结果 172株CRKP对CAZ-AVI耐药率为13.4%，对多黏菌素B的耐药率为1.7%，对替加环素耐药率为1.2％。PCR检测172株CRKP菌株产碳青霉烯酶基因，其中产碳青霉烯酶菌株166株（96.5%）。以PCR检测产碳青霉烯酶基因为参考方法，NG-Test? CARBA5检测碳青霉烯酶基因型KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48-like，显示特异性为100%，灵敏度为99.4%。结论 CAZ-AVI、多黏菌素B以及替加环素对本地区CRKP菌株具有较好的体外抗菌活性，对采用NG-Test? CARBA5试验检测CRKP产碳青霉烯酶的耐药基因型，有利于早期指导临床实现个体化精准治疗。

关键词：耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌；头孢他啶/阿维巴坦；多黏菌素B；替加环素；微量肉汤稀释法

中图分类号：R978.1文献标志码：A

In vitro antibacterial activity of ceftazidime/avibatan， polymyxin B and tigecycline against carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae

Chen Yili1， Liu Pingjuan1， Yu Guangchao2， Wu Zhongwen1， Guo Penghao1， Peng Yaqin1， Li Yuxin3，

Liu Min1， and Liao Kang1

（1 Department of Laboratory Medicine， the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080;

2 Department of Laboratory Medicine， the First Affiliated Hospital of Jinan University （Guangzhou Overseas Chinese Hospital）， Guangzhou 510080；3 Guangdong Medical University， Dongguan 523000）

Abstract Objective To evaluate the in vitro antibacterial effect of ceftazidime/averbactam （CAZ-AVI）， polymyxin B and tegacyclin on carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae， and to guide the clinical correct selection and rational use of antibacterial drugs. Methods 172 strains CRKP were collected from 8 tertiary general hospitals in Guangdong Province from 2018 to 2021. Polymerase chain reaction （PCR） and NG-Test? CARBA5 were used for the detection of the five common carbapenemase resistance genes. The minimal inhibitory concentration （MIC） values of CAZ-AVI， polymyxin B and tigecycline were detected by broth microdilution method. Results The resistance rates of 172 CRKP strains to CAZ-AVI， polymyxin B and tigecycline were 13.4%， 1.7% and 1.2%， respectively. 166 strains （96.5%） among the 172 CRKP strains carried carbapenemase resistance genes by PCR detection which was used as the standard method. NG-Test? CARBA5 were used to detect carbapenem genotypes KPC， NDM， VIM， IMP and oxa-48-like. The specificity was 100% and the sensitivity was 99.4%. Conclusion CAZ-AVI， polymyxin B and tigecycline had good in vitro antibacterial activity against CRKP strains in local region. NG-Test? CARBA5 test is a rapid and accurate method to detect carbapenemase genotypes， which is conducive for early guiding clinical practice and realizing individualized and accurate treatment.

Key words Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae; Ceftazidime/avibatan; Polymyxin B; Tigecycline；Broth microdilution

近年来，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）已成为全球公共卫生领域的重大挑战，给临床治疗带来巨大的困难与挑战。根据2021年CHINET中国细菌耐药监测结果显示，肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药率高达20.8%，对美罗培南耐药率达21.9%。其中，对CRKP体外抗菌活性较好的药物包括多黏菌素B（耐药率3.8%），替加环素（耐药率3.9%），以及头孢他啶/阿维巴坦（耐药率7.4%）[1]。众所周知，快速准确的药物敏感性结果在临床精准合理用药中发挥重要作用，然而，现阶段临床实验室对头孢他啶/阿维巴坦、黏菌素和替加环素的常规体外药敏试验存在方法上的局限。CAZ-AVI上市不久，目前国内没有任何商品化的检测试剂可检测MIC。对于肠杆菌目，纸片扩散法会出现假敏感和假耐药现象[2]。多黏菌素类分子量大，在琼脂内不易扩散，2017年CLSI不再推荐错误率高的纸片扩散法、琼脂扩散法和浓度梯度扩散法（包括E试验）[3-4]。而替加环素理化性质不稳定，不宜在光线或空气中久置。Vitek 2系统检测的替加环素药敏结果在验证阶段缺少足够的耐药菌株，且整体MIC偏高，假耐药菌株多[5-6]。因此，本研究拟通过微量肉汤稀释法（broth microdilution，BMD），评价本地区临床分离的CRKP菌株对头孢他啶/阿维巴坦、多黏菌素B和替加环素的体外抗菌活性，观察这3种抗菌药物对携带不同碳青霉烯酶耐药基因型的CRKP菌株的特征，为临床精准合理用药提供可靠依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

收集中山大学附属第一医院、中山大学附属第二医院、中山大学附属第三医院、暨南大学附属第一医院、广东药科大学附属第一医院、南方医科大学附属第三医院、佛山市第一人民医院以及深圳市人民医院，共8家本地区的三级综合医院，自2018—2021年临床分离的CRKP共172株。CRKP菌株入选标准：经Vitek-2全自动微生物鉴定药敏分析仪，鉴定为肺炎克雷伯菌的菌株，药敏试验结果参照CLSI 2021 M100标准进行判读，厄他培南最低抑菌浓度（MIC）为≥2 μg/mL。剔除同一患者相同部位分离的重复菌株。试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.1.2 主要仪器与试剂

哥伦比亚血琼脂平板（郑州安图公司）、Applied biosystems荧光定量扩增仪（赛默飞公司）、GeneGreen核酸染料和2×Taq PCR Mix（北京天根生化科技有限公司）、Trans2k DNA Marker（北京全式金生物）、碳青霉烯酶基因PCR引物（上海生工生物）、NG-Test? CARBA5检测试剂盒（批号： 20120211）（复星诊断科技（长沙）有限公司）、多黏菌素B標准品（批号130313-201310，效价7791 UNITs/mg）。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验方法

微量肉汤稀释法参考2018年CLSI M07-A11（需氧菌的抗菌药物稀释法敏感性试验）推荐的方法进行。

1.2.2 折点判断

①头孢他啶/阿维巴坦：按CLSI M100（2021年版）[7]的推荐：敏感≤8/4 mg/L，耐药≥16/4 mg/L。②多黏菌素B（PB）：按欧洲抗微生物药物敏感性委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）10.0版[8]多黏菌素B的折点，即敏感≤2 mg/L，耐药≥4 mg/L。③替加环素（TGC）：判定折点按照美国FDA和中国国家药品监督管理局关于肠杆菌科的标准，即敏感≤2 mg/L，中介＝4 mg/ L，耐药≥8 mg/L。

1.2.3 PCR技术检测碳青霉烯酶基因

将保存的临床菌株转种到室温的血琼脂平板，放置37 ℃、5%CO2细菌孵育箱过夜培养。采用加热煮沸法提取细菌DNA模板，采用10 μL的一次性接种环挑取2～3个单菌落细菌，置于100 μL无菌去核酸酶水中制成菌悬液，于100 ℃干式恒温器中裂解10 min，冰浴10 min，离心12000 r/min，10 min，将含DNA的上清液转到新EP管中，用于PCR检测。本次实验共检测5个临床常见的碳青霉烯酶基因，基因名称及对应引物序列参考文献[9]，引物由上海生工公司合成，引物设计如下（表1），循环体系：预变性94 ℃，5 min、变性94 ℃，30 s、退火58 ℃，30 s、延伸72 ℃，60 s（变性、退火、延伸共25循环）、最后延伸72 ℃，10 min。得到PCR扩增产物后进行电泳。

1.2.4 NG-Test? CARBA5检测碳青霉烯酶基因型

按照NG-Test? CARBA5检测试剂盒（复星诊断科技（长沙）有限公司批号：20120211）说明书操作：在EP管中滴加150 ?L的提取缓冲液，挑取经纯化过夜培养的新鲜菌落至EP管缓冲液中，在漩涡震荡器上震荡混匀数秒，静置15 min待用。使用加样枪吸取100 ?L制备好的液体加到检测卡的样本区，15 min后读取结果。

2 结果

2.1 CRKP菌株对3种抗菌药物的耐药性分析

微量肉汤稀释法药敏试验结果显示，172株CRKP对头孢他啶/阿维巴坦的耐药率为3.4%（MIC50 1 μg/mL，MIC90 256 μg/mL）；多黏菌素B的耐药率为1.7%（MIC50 0.125 μg/mL，MIC90 0.5 μg/mL）；对替加环素的耐药率为1.2%（MIC50 1 μg/mL，MIC90 4 μg/mL），

见表2。

2.2 3种药物交叉耐药性分析

本研究通过对172株CRKP菌株的3种药物MIC值的两两对比，13株（7.6%）菌株对头孢他啶/阿维巴坦耐药而对多黏菌素B敏感（图1）；12株（7.0%）菌株对头孢他啶/阿维巴坦耐药而对替加环素敏感（图2）；3株（1.7%）菌株对多黏菌素B耐药而对替加环素敏感（图3）。

2.3 PCR方法检测碳青霉烯酶耐药基因结果

本研究通过PCR方法分析172株CRKP菌株产碳青霉烯酶的结果，得到产碳青霉烯酶的菌株有166株（96.5%），其中143株CAZ-AVI敏感菌株中143株（100%）产blaKPC，23株CAZ-AVI耐药菌株中4株（17.4%）产blaKPC，12株（52.2%）产blaNDM，2株（8.7%）产blaIMP，4株（17.4%）产blaNDM+IMP双酶，1株（4.3%）产blaKPC+NDM双酶，见图4。

163株多黏菌素B敏感菌株中146株（89.6%）产blaKPC，3株多黏菌素B耐药菌株中1株产blaKPC，1株产blaNDM，1株产blaNDM+IMP双酶。图5。

138株替加环素敏感菌株中120株（87.0%）产blaKPC，11株（8.0%）产blaNDM；2株替加环素耐药菌株均产blaKPC；26株替加环素中介菌株中25株产blaKPC，1株产blaNDM，图6。

2.4 NG-Test? CARBA5检测结果

NG-Test? CARBA5结果显示：172株CRKP中有165株（95.9%）产碳青霉烯酶。其中KPC型146株（88.5%），NDM型12株（7.3%），IMP型2株（1.2%），同时产KPC和NDM型1株（0.6%），同时产NDM和IMP型4株（2.4%）。与PCR法检测碳青霉烯酶基因型的一致性，见表3。NG-Test?CARBA5检测碳青霉烯酶基因型KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48-like的结果特异性为100%，灵敏度为99.4%。

3 讨论

头孢他啶/阿维巴坦、多黏菌素（包括多黏菌素B和黏菌素）以及替加环素被认为是目前治疗耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌所致感染最有效的药物[10]，快速准确的药物敏感性结果在临床精准合理用药中发挥重要作用。然而，由于国内临床实验室药敏方法的可及性问题，目前对于这3种抗生素体外药敏实验的结果需要谨慎评价，BMD是多黏菌素类和替加环素药敏检测的金标准，微量肉汤稀释法是评价头孢他啶/阿维巴坦体外药敏活性的金标准，有条件的实验室推荐使用微量肉汤稀释法评价这3种药物体外药敏活性[11]。

目前针对本地区临床收集的CRKP菌株对于CAZ-AVI、多黏菌素B和替加环素这3种药物的体外药敏数据鲜有报道，本研究采用微量肉汤稀释法进行多中心评价，填补了本地区的数据空白。本研究结果显示，172株CRKP菌株对CAZ-AVI、多黏菌素Ｂ和替加环素的耐药率分别为13.4%、1.7%和1.2%。

CAZ-AVI是头孢他啶和阿维巴坦组成的新型酶抑制剂合剂，阿维巴坦作为新型β-内酰胺抑制剂，通过共价（缓慢可逆）结合，使自身结构不发生改变，因此抑酶作用更长效[12]，可有效抑制A类、C类和部分D类酶。有一项研究表明头孢他啶/阿维巴坦对耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌显示出了良好的抗菌活性，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌感染患者给予头孢他啶/阿维巴坦治疗，治愈率达到了95％[13]；但对产B类金属酶菌株无效，因为阿维巴坦的抑酶谱缺乏丝氨酸残基活性位点[14]。因此，早期快速的对CRKP进行酶型检测，有利于临床医生经验性选择抗生素时，选用CAZ-AVI治疗B类金属酶以外的CRKP引起的感染，有效提高患者治疗的成功率。本研究结果显示，172株CRKP菌株中超过95%产碳青霉烯酶，其中CAZ-AVI敏感株均产A类酶KPC型。值得关注的是，本地区13.4%的CRKP菌株对CAZ-AVI耐药，高于浙江省的耐药率[14]。在这些CAZ-AVI耐药株中，超过80%携带B类金属酶基因，约17%携带blaKPC，低于浙江省报道的约40%的KPC型[15]。研究发现，对CAZ-AVI耐药的KPC型CRKP主要由于KPC-2型的点突变和KPC高表达导致CAZ-AVI耐药[15]。因此，密切监测CRKP对CAZ-AVI的耐药性变化，寻找早期快速的方法对KPC变异体进行检测或鉴别，将是抗菌药物管理的一个关键点。

多黏菌素类抗生素是杀菌剂，与细胞膜的脂多糖结合，从而破坏细菌的细胞膜[16]。在体外药敏试验中，黏菌素和多黏菌素B是等效药，前者可预测后者的结果，反之亦然。张鑫等[17]对多黏菌素B治疗碳青霉烯类耐药菌感染167例患者的临床疗效进行了评价，发现多黏菌素B不仅疗效好，且不良反应发生率低；多黏菌素B总累积剂量、多黏菌素B治疗时间、机械通气、血管活性药物和多部位感染是影响多黏菌素B临床疗效的相关因素。本研究结果显示，多黏菌素B对产A类、B类碳青霉烯酶的CRKP均具有较好的体外活性，仅发现3株多黏菌素B耐药菌，耐药机制需要进一步研究。

替加环素（tigecycline）是新型甘氨酰环素类抗生素，属于半合成四环素米诺环素的衍生物[18]。主要通过抑制细菌的蛋白质合成，达到抗菌作用，常用于多重耐药革兰阴性杆菌引起的感染[19]。梁等[20]的研究表明替加环素在CRKP引起的感染，对产KPC型CRKP有较好的抗菌活性。本研究結果与国内报道一致[20]，替加环素对产A类、B类碳青霉烯酶的CRKP均具有较好的体外活性。

值得注意的是，体外药敏试验结果显示多黏菌素B和替加环素的耐药率均低于头孢他啶/阿维巴坦，具有更好的体外抗菌活性。但是，当多黏菌素的体外药物敏感性结果提示耐药时，它的肾毒性、神经毒性将大大提高[21]。而替加环素主要推荐用于3个适应症[22]，而临床应用大多数属于超适应症使用，目前缺乏严格的临床研究结果支持和证明其有效性及安全性[23-24]。因此，临床在应用多黏菌素和替加环素抗感染时有一定的限制。而头孢他啶/维巴坦在临床应用中，患者对药物的耐受性较好，出现的药物不良反应较低[25-26]，是临床治疗CRKP的首选。

本研究結果显示，NG-Test?CARBA5检测碳青霉烯酶基因型KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48-like的结果特异性为100%，灵敏度为99.4%，与Hopkins等[27]评估用于检测KPC的NG-Test? CARBA5免疫层析法检测的结果一致。在治疗方面，CRKP抗感染药物的选择取决于特定的碳青霉烯酶[27]。对产KPC和OXA-48型丝氨酸碳青霉烯酶菌株，首选头孢他啶-阿维巴坦，菌株通常仅对替加环素、多黏菌素或头孢他啶-阿维巴坦敏感[11，29-30]。如果产生NDM（或任何其他金属酶），首选的抗生素是头孢他啶-阿维巴坦加氨曲南，该类型碳青霉烯酶的活性不能被阿维巴坦抑制，产酶菌株通常仅对替加环素和多黏菌素敏感[11， 31-32]。因此，鉴于不同碳青霉烯酶的独特特点，快速、可靠地区分这些碳青霉烯酶将为适当的治疗提供有价值的信息。NG-Test? CARBA5作为一种高效、快速、方便的诊断方法，能够精准鉴定最常见的5种碳青霉烯酶，除了操作简单外，它还能在15 min内显示了5种主要碳青霉烯酶的结果，有助于简化碳青霉烯酶检测的复杂常规工作流程，对CRE流行病学研究和医院感染控制都具有重要意义。

本研究存在一些局限性：一方面，对于碳青霉烯酶型未进一步测序明确具体的亚型，拟在下一步研究中对这些菌株的型别进行确认；另一方面，此3种抗菌药物联合用药的效应评估，将在进一步研究中继续深入。

综上所述，头孢他啶/阿维巴坦、多黏菌素B以及替加环素对本地区CRKP菌株具有较好的体外抗菌活性，切实做好细菌耐药监测工作，可为临床合理使用抗生素提供重要科学依据。对采用NG-Test? CARBA5试剂检测CRKP产碳青霉烯酶的基因型，有利于指导临床实现早期、快速的个体化精准治疗。

致谢：暨南大学附属第一医院临床检验中心余广超教授，中山大学附属第三医院医学检验科梁家隐教授，广东药科大学附属第一医院检验科卢景辉教授，南方医科大学第三附属医院检验科孙恒彪教授，广东省佛山市第一人民医院检验科吴奎海教授，暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院吴劲松教授，以及中山大学附属第二医院医学检验科刘晓强教授为本研究提供实验菌株。

参 考 文 献

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