彝医药防疫古方的核心成分青蒿素和槲皮素抑制新冠病毒刺突蛋白的转录和翻译

吴伟 吴俊汐 纪旭旭 刘戟 刘彬 耿福昌

摘要：目的 研究青蒿素和槲皮素单用或联合使用是否可以通过抑制刺突蛋白（spike protein， S）的转录和翻译来治疗新冠病毒感染（coronavirus disease-2019， COVID-19）。方法 采用梯度浓度的青蒿素或槲皮素处理Vero E6细胞，进行细胞活力测定；采用新冠病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）的S基因质粒转染Vero E6细胞，而后采用青蒿素或槲皮素单独或联合处理，以检测S蛋白的基因转录和蛋白质翻译水平。结果 青蒿素或槲皮素处理可以显著降低SARS-CoV-2 S基因质粒转染后Vero E6细胞内S蛋白的mRNA和蛋白表达水平，差异具有统计学意义（P<0.01， P<0.05），并且，20 ?mol/L或200 ?mol/L的青蒿素與50 ?g/mL的槲皮素联合用药比单独用药能够更为显著地降低S蛋白的蛋白表达水平，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 单独和联合使用青蒿素和槲皮素均能有效地抑制SARS-CoV-2 S蛋白的基因转录和蛋白翻译。

关键词：青蒿素；槲皮素；SARS-CoV-2；刺突蛋白；转染；基因转录；蛋白翻译；彝族药物

中图分类号：R966文献标志码：A

Artemisinin and quercetin， the core components of the ancient prescriptions for epidemic prevention of Yi medicine， inhibit the transcription and translation of SARS-COV-2 spike protein

Wu Wei1，2，3.4， Wu Junxi5， Ji Xuxu3， Liu Ji3， Liu Bin2， and Geng Fuchang2

（1 Research Institute of Medicine and Herbs of Yi Nationality & Gastroenterology Department， Liangshan Prefecture Integrated Traditional and Western Medicine Hospital， Xichang 615000; 2 Good Doctor Pharmaceutical Group Co.，Ltd. Chengdu 610073; 3 Department of Biochemistry and Molecular Biology， West China School of Basic Medical Science and Forensic Medicine， Sichuan University， Chengdu 610041; 4 Remeadjohn Technology Co.， Ltd.， Chengdu 610044; 5 School of Medical and Life Science， Chengdu University of TCM， Chengdu 610000）

Abstract Objective To investigate whether the single or combined treatments with artemisinin and quercetin can improve corona virus disease 2019 （COVID-19） via inhibiting the transcription and translation of spike protein （S）. Methods Vero E6 cells were treated with artemisinin or quercetin in gradient concentration， and the cell viability was determined. Vero E6 cells were transfected with severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 （SARS CoV-2） S gene plasmid， and then treated with artemisinin or quercetin alone or combined to detect the level of the gene transcription and protein translation of S protein. Results The treatments with artemisinin or quercetin could significantly reduce the expression levels of mRNA and protein of S protein in Vero-E6 cells after transfected with SARS CoV-2 S gene plasmid， and the difference was statistically significant（P<0.01， P<0.05）. In addition， the combined treatment of 20 or 200 ?mol/L artemisinin and 50 ?g/mL quercetin could significantly more decreased the protein expression level of S protein compared to the single treatments， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The single or combined treatments with artemisinin and quercetin can effectively inhibit the gene transcription and protein translation of SARS-CoV-2 S protein.

Key words Artemisinin; Quereetin; SARS-CoV-2; Spike protein; Transfection; Gene transcription; Protein translation; Medicine and Herbs of Yi Nationality

世界卫生组织于2023年2月发布的最新数据表明，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒感染（coronavirus disease-2019， COVID-19）大流行已在全球范围内造成7.55亿确诊病例感染，680多万死亡[1]。目前，SARS-CoV-2已衍生出多种变体，包括奥密克戎变体，它是一种严重变异的病毒，具有极高的感染风险[2]。目前的新型冠状病毒感染疫苗能否有效预防这些新菌株仍在调查中[3]。鉴于此，一些国家在预防和抗击新型冠状病毒感染的健康指南中也纳入了替代疗法[4]。天然产物中的化合物具有广泛的生物和治疗特性，对新型冠状病毒感染具有潜在的预防和治疗作用[5]。寻求有效且容易获得的天然产品或化合物作为新型冠状病毒感染的替代和补充药物，可能有助于降低发病率、住院率、疾病严重程度和死亡率。

新冠病毒进入细胞由病毒表面锚定的刺突蛋白（S蛋白）介导，该蛋白具有明显的β属冠状病毒S蛋白特性，S1亚基发挥与受体识别和结合的功能，S2亚基参与膜融合过程[6]。冠状病毒进入宿主细胞是病毒感染性和发病机制的重要决定因素，也是宿主免疫监视的主要目标[7]。因此，S蛋白成为了临床治疗新冠病毒感染药物以及疫苗研制倾向选择的靶点。

据彝医药古籍《聂苏诺期》记载，中国有一种古老的彝族医药防疫药方。彝族医药采用该熏蒸法防治流行性传染病，至今仍经常使用[8]。该方剂主要药材是青蒿（ARTEMIAE ANNUAE HERBA）和侧柏叶（PLATYCLADI CACUMEN）。青蒿素 （artemisinin， A） 是青蒿中一种具有过氧化物部分的倍半萜内酯[9]，研究发现青蒿素在Vero E6细胞中测定的预处理或后处理抗SARS-CoV-2测定中显示出优异的效果（选择性指数分别为35或54）[10]。槲皮素 （quercetin， Q） 是侧柏叶中的一种黄酮类化合物，经常用作检测6种黄酮类化合物的内部参照物[11]。研究发现槲皮素在VeroE6细胞中测定的抗SARS-CoV-2测定中也显示出良好的效果（选择性指数=39.81）[12]。

综上，本文旨在研究青蒿素和槲皮素单用或联合使用是否可以通过抑制S蛋白的转录和翻译来减轻新冠病毒感染症状。

1 实验材料与方法

1.1 細胞、药品和试剂

Vero E6非洲绿猴肾细胞购自北纳创联生物技术有限公司；青蒿素购自北京索莱宝科技有限公司；槲皮素购自上海麦克林生化科技有限公司；CCK-8试剂盒购于美国Bimake生物科技有限公司；GAPDH单克隆鼠抗和SARS-CoV-2 spike protein单克隆鼠抗购自Cell signaling公司；SARS-CoV-2 S基因质粒和pUC57质粒购于北京擎科生物科技有限公司；DMEM培养基购自美国Invitrogen公司；BCA蛋白定量试剂盒、高敏型ECL化学发光检测试剂盒、HisScript? III 1st Strand cDNA合成试剂盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix购于南京诺唯赞医疗科技有限公司；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、双色SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）、蛋白酶抑制剂PMSF、DEPC水（DNase、RNase free）、Lipo6000?转染试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；NEWZERUM标准级胎牛血清购于新西兰Newzerum公司；逆转录试剂盒购自美国GeneCopoeia。

1.2 细胞培养

将含有1 mL Vero E6细胞悬液冻存管在37℃水浴中快速摇晃解冻，加4 mL含10%FBS的DMEM培养基混合均匀；在1000 r/min条件下离心4 min，弃去上清液，加1～2 mL培养基后用枪轻轻吹打混匀；将Vero E6细胞接种至细胞培养板， 在37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养过夜；Vero E6细胞密度达80%～90%，即可进行传代培养。

1.3 质粒转染

将pUC57质粒转染设为NC组，SARS-CoV-2 S基因质粒设为SARS-COV-2 S组。转染前1～2 d，将细胞以适宜密度接种到96孔板内培养至细胞密度达到约70%～90%；将孔内培养基更换为新鲜含10%FBS的DMEM培养基；取两个洁净无菌离心管，分别加入对应体积无血清DMEM培养基，然后于其中一管加入质粒DNA，另一管加入Lipo6000?转染试剂，并用枪轻轻吹打混匀；室温静置5 min后，将含有质粒DNA的培养液用枪轻轻加入含Lipo6000?转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀；室温静置5 min后，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀；继续培养约24～48 h后，提取RNA及蛋白检测转染效果。

1.4 细胞活力测定

将细胞以适宜密度接种到96孔板内培养至细胞密度达到约70%～90%；吸出96孔板孔内的培养基，加入适量PBS清洗细胞；而后使用无血清DMEM培养基和CCK8溶液配置反应液（比例为10：1），混合均匀后，每孔加入100 μL反应液，并设置空白未铺细胞对照孔加入100 μL反应液，放置于37 ℃和5%CO2恒温箱内孵育1 h；在450 nm处测量吸光度。

1.5 Western Blot

从pUC57质粒和SARS-CoV-2 S基因质粒转染的Vero E6细胞中提取所有蛋白。使用BCA试剂定量蛋白质裂解物。蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）分离，转移到硝化纤维素膜（0.45 μm NC）上，然后室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h。4 ℃下用特异性一级抗体进行免疫印迹过夜，使用HRP结合的二级抗体在室温下孵育1 h。使用高灵敏度ECL化学发光检测试剂盒检测蛋白质条带。

1.6 qPCR检测S-蛋白基因表达

使用TRIzol从pUC57质粒和SARS-CoV-2 S基因质粒转染的Vero E6细胞中提取RNA。采用逆转录试剂盒，根据说明书进行逆转录。用Primer BLAST软件设计S蛋白的特异性正向和反向引物，参见表1。而后使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行绝对定量分析。数据显示为对照组的平均折叠变化。

1.7 数据分析

所有统计学分析均通过GraphPad Prism 7.0进行，计量资料以（x±s）两组比较均采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

2 结果与分析

2.1 青蒿素与槲皮素对Vero E6细胞活力的影响

采用青蒿素（0、5、10、20、50、100、150、200、300、500 ?mol/L）和槲皮素（0、3、5、6.25、12.5、25、50、100、150、200 ?g/mL）分别与Vero E6细胞在7 ℃、体积分数为5% CO2的培养条件下共孵育24 h，而后使用CCK8检测细胞活性。如图1所示，结果如下，与对照组（0 ?moL/L的青蒿素或0 ?g/mL的槲皮素）比较，青蒿素在小于500 ?moL/L的浓度范围内以及槲皮素在小于200 ?g/mL的浓度范围内并不能诱导Vero E6细胞细胞活力的显著性下降（P>0.05）。青蒿素在小于500 ?moL/L的浓度范围内以及槲皮素在小于200 ?g/mL的浓度范围内对Vero E6细胞无明显的细胞毒性。

2.2 质粒转染对Vero E6细胞毒性作用

将预先铺设在96孔板中的Vero E6细胞分为4组：①对照组; ②Lipo6000?组（Lipo6000?转染试剂）; ③NC组（pUC57质粒转染）; ④SARS-CoV-2 S组（SARS-CoV-2 S基因质粒转染），使用CCK8检测细胞活力。结果如下，与对照组比较，Lipo6000?组、NC组和SARS-CoV-2 S组的细胞活力无显著性差异（P>0.05），参见图2，证明pUC57质粒和SARS-CoV-2 S基因质粒转染以及Lipo6000?转染试剂对Vero E6细胞无明显的细胞毒性。

2.3 SARS-CoV-2 S基因质粒转染后Vero E6细胞内S蛋白的mRNA和蛋白表达

将预先铺设在96孔板中的Vero E6细胞分为2组：NC组（pUC57质粒转染）和SARS-CoV-2 S组（SARS-CoV-2 S基因质粒转染）。转染24 h后，分别提取细胞RNA和蛋白，采用qPCR和Western Blot检测mRNA与蛋白的表达水平变化。结果表明，与NC组比较，SARS-CoV-2 S组的S蛋白mRNA表达水平增加了4.8倍（P<0.01），蛋白表达水平增加了2.7倍（P<0.001），参见图3，证明质粒转染成功且能在Vero E6细胞中顺利表达。

2.4 青蒿素或槲皮素单独使用对SARS-CoV-2 S基因质粒转染后Vero E6细胞内S蛋白的mRNA和蛋白表达的抑制作用

为研究青蒿素对SARS-CoV-2 S基因质粒转染后Vero E6细胞内S蛋白的mRNA和蛋白表达的抑制作用，实施步骤如下：①将SARS-CoV-2 S基因质粒转染到铺设于96孔板中的Vero E6细胞中；②将细胞随机分为6组：对照组（青蒿素0 ?mol/L浓度组）、青蒿素5 ?mol/L浓度组、青蒿素20 ?mol/L浓度组、青蒿素50 ?mol/L浓度组、青蒿素100 ?mol/L浓度组和青蒿素200 ?mol/L浓度组；③将步骤B设定的处理药物分别加入孔内与细胞共孵育24 h；④提取细胞RNA和蛋白，并进行qPCR和Western Blot检测。

结果表明：①与对照组比较，其他浓度组的青蒿素均诱导了SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表达水平显著性下调（P<0.05，P<0.01）；②与5、50和100 ?mol/L浓度组比较，20和200 ?mol/L浓度的青蒿素能够更为显著地诱导SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表达水平下调（P<0.05），抑制率达到80%；③与对照组比较，20和200?mol/L浓度的青蒿素诱导了SARS-CoV-2 S蛋白的mRNA表达水平的显著性下调（P<0.05）。

为研究槲皮素对SARS-CoV-2 S基因质粒转染后Vero E6細胞内S蛋白的mRNA和蛋白表达的抑制作用，将细胞随机分为6组：①对照组（槲皮素0浓度组）， ②槲皮素6.25 ?g/mL浓度组， ③槲皮素12.5 ?g/mL浓度组， ④槲皮素25 ?g/mL浓度组， ⑤槲皮素50 ?g/mL浓度组， ⑥槲皮素100 ?g/mL浓度组；其他实施步骤参照“2.4”。结果如下：①与对照组比较，除12.5 ?g/mL浓度组外，其他浓度组的槲皮素均诱导了SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表达水平的显著性下调（P<0.05，P<0.01）；②与6.25、25和100 ?g/mL浓度组比较，50 ?g/mL浓度的槲皮素能够更为显著地诱导SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表达水平下调（P<0.05），抑制率达到60%；③与对照组比较，50 ?g/mL浓度的槲皮素诱导了SARS-CoV-2 S蛋白的mRNA表达水平的显著性下调（P<0.001）。

2.5 青蒿素与槲皮素联合用药与单独用药对SARS-CoV-2 S基因质粒转染后Vero E6细胞内S蛋白的蛋白表达的抑制作用比较

为探讨青蒿素与槲皮素联合用药与单独用药对SARS-CoV-2 S基因质粒转染后Vero E6细胞内S蛋白的蛋白表达的抑制作用比较，步骤如下：①根据本研究“2.4”部分的研究结果，选择20、200 ?mol/L浓度的青蒿素及50 ?g/mL浓度的槲皮素作为干预药物；②将SARS-CoV-2 S基因质粒转染到铺设于96孔板中的Vero E6细胞中；③将细胞随机分为6组：对照组（青蒿素和槲皮素浓度均为0）、青蒿素（20 ?mol/L）组、青蒿素（200 ?mol/L）组、槲皮素（50 ?g/mL）组、青蒿素（20 ?mol/L）+槲皮素（50 ?g/mL）组、青蒿素（200 ?mol/L）+槲皮素（50 ?g/mL）组；④将步骤C设定的干预药物分别加入孔内与细胞共孵育24 h；⑤提取细胞蛋白，进行Western Blot检测。

结果如下：①与对照组比较，其他各组的S蛋白的蛋白表达水平均显著下调（P<0.05）；②20或200 ?mol/L的青蒿素与50 ?g/mL的槲皮素联合用药比单独用药能够更为显著地下调S蛋白的蛋白表达水平（P<0.05），参见图6， 证明20或200 ?mol/L的青蒿素与50 ?g/mL的槲皮素联合用药比单独用药能够更为有效地抑制SARS-CoV-2 S基因质粒转染后Vero E6细胞内S蛋白的蛋白表达。

3 讨论

有效地控制新冠病毒基因组在宿主细胞内的复制表达过程，是控制新冠病毒传播的重要环节[13]。研究发现青蒿素（<500 ?mol/L）和槲皮素（<200 ?g/mL）以及SARS-CoV-2 S基因质粒转染对Vero E6细胞无细胞毒性作用。SARS-CoV-2 S基因质粒转染后，S蛋白的基因在Vero E6细胞内成功地进行了基因转录和蛋白翻译。而后，使用彝药防疫古方的核心组分青蒿素和槲皮素对转染SARS-CoV-2 S基因质粒后的细胞进行处理，发现青蒿素与槲皮素单独用药在部分浓度对S蛋白的基因表达和蛋白翻译有着显著的抑制作用，且20或200 ?mol/L的青蒿素与50 ?g/mL的槲皮素联合用药的抑制效果显著优于单独用药。以上证据表明：彝药防疫古方的核心组分青蒿素和槲皮素单独和联合使用均能有效地抑制SARS-CoV-2 S蛋白的基因转录和蛋白翻译。

参 考 文 献

https：//www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019.

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