糖尿病患者肠道定植肺炎克雷伯菌的分子流行病学特征

薛兆平 伊茂礼 徐卫皓 张玉梅

摘要：目的 了解糖尿病患者腸道肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）定植率、耐药性以及分子流行病学特征。方法 收集烟台某医院内分泌科就诊的糖尿病患者粪便，分离培养和鉴定KP，使用拉丝试验测定其黏液表型，使用K-B纸片扩散法测定其耐药性，通过全基因组测序分析其荚膜血清型、毒力基因和多位点序列分型。结果 收集145份糖尿病患者的粪便标本，检出50株KP，检出率为34.48%，检出率在性别、糖尿病病程长短、血糖控制方面差异均无统计学意义。50株KP中高黏液表型菌株18株。检出的KP菌株对大部分常用抗生素耐药率较低。50株KP分析出26种血清型，其中K1血清型（20.00%，10/50）占比最高。K1血清型在高黏液表型KP中的比例（44.44%，8/18）明显高于非高黏液表型KP（6.25%，2/32）。高黏液表型KP在毒力基因all、arc、clb、fdr、fyu、glc、glx、hyi、iro、irp、iuc、iut、mce、rmpA、rmpA2、ybb、ybt和ylb的携带率高于非高黏液表型KP。 多位点序列分型中分析出34种ST型，ST23检出率最高（14.00%，7/50），且均为K1血清型。结论 烟台地区糖尿病患者肠道中肺炎克雷伯菌当前定植率较高，耐药率较低，高黏液表型KP携带更多的毒力基因，K1-ST23菌株已初步占优势。

关键词：糖尿病；肺炎克雷伯菌；耐药性；分子流行病学

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Molecular epidemiological characteristics of intestinal colonization of Klebsiella pneumoniae in diabetic patients

Xue Zhaoping1，2 ，Yi Maoli2， Xu Weihao2， and Zhang Yumei1

（1 Binzhou Medical University， Yantai 264003; 2 Laboratory Center of Yantai Yuhuangding Hospital， Yantai 264000）

Abstract Objective To understand the colonization rate， drug resistance， and molecular epidemiological characteristics of Klebsiella pneumoniae （KP） in the intestinal tract of diabetic patients. Methods The stool samples of diabetic patients in the endocrinology department of a hospital in Yantai were collected， and Klebsiella pneumoniae were isolated， cultured， and identified. The mucus phenotype of Klebsiella pneumoniae was detected by string test， and its drug resistance was detected by K-B method. The capsular serotype， virulence gene and multilocus sequence typing were analyzed by whole genome sequencing. Results 145 stool samples from diabetic patients were collected， and 50 strains of Klebsiella pneumoniae were detected， with a detection rate of 34.48%. There were no significant differences in the detection rates concerning gender， length of diabetes duration， or glycemic control. 18 of 50 KP strains with intermediate to high mucoid phenotype. The detected KP strains were less resistant to most commonly used antibiotics. 50 KP strains were detected with 26 serotypes， among which the K1 serotype （20.00%， 10/50） accounted for the highest proportion. The proportion of K1 serotype in hypermucinous phenotype KP （44.44%， 8/18） was significantly higher than that in non-hypermucinous phenotype KP （6.25%， 2/32）. The virulent gene carrying rates of high mucus phenotype KP in all， arc， clb， fdr， fyu， glc， glx， hyi， iro， irp， iuc， iut， mce， rmpA， rmpA2， ybb， ybt and ylb were higher than that of non-high mucus phenotype KP. 34 types were separated out， the detection rate of ST23 was the highest （14.00%， 7/50） which were K1 serotypes. Conclusion Some diabetic patients in Yantai carry Klebsiella pneumoniae in their intestinal tract. The current drug resistance rate is low， and the high-mucus phenotype KP carries more virulence genes. K1-ST23 strain has been initially dominant.

Key words Diabetes; Klebsiella pneumoniae; Drug resistance; Molecular epidemiology

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）作为临床微生物中检出率较高的肠杆菌目条件致病菌，广泛分布在自然环境中。健康人群的肠道和呼吸道等部位均有定植，在特殊情况下可导致医院获得性感染和社区获得性感染，引起肝脓肿、眼内炎、肺炎和尿路感染等[1-3]。人体肠道是肺炎克雷伯菌最主要的储存库之一，其在人体肠道中的定植被认为是发生肺炎克雷伯菌肠外感染的关键风险因素[4]。糖尿病在世界范围的流行形势十分严重，可引起多种严重的并发症。国际糖尿病联盟在2021年发表的国际糖尿病流行病学报告统计表明，世界范围糖尿病患病率约10.5%（5.366亿人），并且在不断增加。多项临床研究表明糖尿病是肺炎克雷伯菌侵袭性感染的高危因素[5]，可引起化脓性肝脓肿等疾病。本文对烟台某医院于2021年4月—2022年3月就诊的糖尿病患者粪便标本进行肺炎克雷伯菌的分离、培养和鉴定，以期了解该地区糖尿病患者肠道肺炎克雷伯菌的携带情况，耐药性以及分子流行病学特征。

1 材料与方法

1.1 标本收集

收集烟台某医院2021年4月—2022年3月内分泌科就诊的糖尿病患者粪便标本，糖尿病患者的诊断符合1999年WHO糖尿病诊断标准[6]，患者采集前1个月内无抗菌药物使用记录，剔除重复就诊采集的标本。

1.2 主要仪器与试剂

HERAcell240i型CO2培养箱（Thermo公司），HHWS-III-400型恒温恒湿培养箱（上海跃进公司）， microflex LT/SH型质谱仪（Bruker公司）。

Mac-Conkey琼脂平板、Golumbia Blood琼脂平板和Mueller Hinton琼脂平板（安图生物公司） ，基质 （Bruker公司），药敏纸片（Oxoid公司）

1.3 方法

1.3.1 培养和鉴定

将粪便标本接种于Mac-Conkey琼脂平板，在35 ℃，7.5%CO2培养箱中培养18～24 h，对可疑菌落使用BRUKER质谱仪鉴定。

1.3.2 高黏液表型检测

将筛查出的肺炎克雷伯菌菌落转种在Golumbia Blood琼脂平板35℃培养18～24 h，用接种环挑取菌落并向上拉起，即拉丝试验（string test），如拉起的黏液絲长度≥5 mm，则为阳性，否则为阴性。拉丝试验阳性的菌株为高黏液KP（hypermucoviscoid Klebsiella pneumoniae， HmKP）。

1.3.3 药敏试验

使用K-B纸片扩散法对12种常规抗菌药物进行药敏试验（表1），根据美国临床和实验室标准化协会推荐的折点判读细菌药敏结果，获得50株KP对该12种抗菌药物敏感（S）、中介（I）、耐药（R）的结果。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.3.4 KP全基因组测序及组装

将筛查出的肺炎克雷伯菌菌株送浙江天科高新技术发展有限公司进行测序组装。应用Institut Pasteur（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）分析菌株的荚膜多糖血清型分型（K型）和毒力基因，应用MLST2.0（https：//cge.food.dtu.dk/services/MLST/）分析其多位点序列分型（multilocus sequence typing， MLST）。

1.3.5 统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行数据统计分析处理，通过率（%）和构成比（%）进行统计学描述，检出率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌检出率

收集2021年4月—2022年3月烟台某医院内分泌科就诊患者的145份粪便标本中，共检出KP50株，总检出率为34.48%（50/145）。其中男性患者78人，KP检出率为33.33%（26/78）；女性患者67人，KP检出率35.82%（24/67），差异无统计学意义（χ2=0.10，P=0.753）。糖尿病病程不超过1年中KP检出率为28.13%（9/32），病程超过1年未超过10年中KP检出率为35.85%（19/53），病程超过10年中KP检出率为36.67%（22/60），差异无统计学意义（χ2=0.743，P=0.690）。糖化血红蛋白≤7.0%患者中KP检出率为16.67%（3/18），＞7.0%患者中检出率为37.00%（47/127），差异无统计学意义（χ2=2.887， P=0.089）。本研究中1型糖尿病共5人，其中2人检出肠道KP定植，2型糖尿病共140人，其中48人检出肠道KP定植。

2.2 高黏液表型菌株

在检出的50株肺炎克雷伯菌中，高黏液表型占36.0%（18/50），拉丝试验见图1。

2.3 药敏试验

本研究的50株肺炎克雷伯菌株，总体耐药率较低，其中对复方磺胺甲恶唑耐药率最高，为16.00%（8/50），其次为环丙沙星6.00%（3/50），对其余10种抗生素的耐药率较低（≤2.00%）（表1）。其中1株肺炎克雷伯菌对阿莫西林/克拉维酸结果为中介，对头孢唑林、头孢呋辛、头孢吡肟、环丙沙星和复方磺胺甲恶唑5种常见抗菌药物均耐药。

2.4 分子生物学特征分析

50株肺炎克雷伯菌中分析出26种血清型（表2），其中K1血清型20.00%（10/50），其次为K57型10.00%（5/50），K2、K9、K54、K63均为4.00%（2/50）。HmKP中44.44%（8/18）为K1血清型，非HmKP中6.25%（2/32）为K1血清型，高黏液表型KP中的K1血清型比例明显高于非高黏液表型KP，差异有统计学意义（χ2=10.886，P=0.001）。本研究的50株KP中毒力基因mrk的检出率为98.00%，HmKP与非HmKP在毒力基因all、arc、clb、fdr、fyu、glc、glx、hyi、iro、irp、iuc、iut、mce、rmpA、rmpA2、ybb、ybt和ylb携带率差异均有统计学意义，而毒力基因kvg、kfu和mrk的携带率差异均无统计学意义（表3）。50株肺炎克雷伯菌的MLST分型分析出34种ST型，其中ST23检出率最高14.00%（7/50），且均为K1血清型，其次2株ST22均为K9型，2株ST111均为K63型，2株ST412均为K57。

3 讨论

根据CHINET细菌耐药检测2021年的数据显示，肺炎克雷伯菌已成为临床分离菌株占比第二的致病菌[7]。有研究表明，肠道部位定植的KP与肝脓肿高度相关，早期发现糖尿病患者肺炎克雷伯菌肠道定植，可能有助于对感染患者做出早期干预治疗[8-9]。因此，作为一种潜在的病原体，存在于肠道中的KP必须得到足够的关注。本研究从收集的145例糖尿病患者粪便标本中检出50株KP菌株，检出率为34.48%（50/145），接近于范沁榕等[10]报道的35.00%，显著高于Zhang等[11]报道的腹泻患者中7.80%的检出率，这可能与不同地区间的生活环境以及人群肠道菌群结构有关。该结果进一步证实了糖尿病患者肠道中存在KP，突显了加强监测的重要性。同时，研究中发现不同病程的糖尿病患者肠道KP携带率差异无统计学意义。糖化血红蛋白可以有效地监测糖尿病患者过去约12周的血糖平均水平，因此被用来作为反映长期血糖控制水平的指标，目前≤7.0%被广泛视为糖尿病糖化血红蛋白的控制标准[12]。本研究中糖化血红蛋白控制良好的患者中KP检出率16.67%，低于控制不达标患者37.00%检出率，但差异无统计学意义。不足的是，本研究中绝大部分研究对象为2型糖尿病，各型糖尿病间的差异还需要大规模流行病学研究。

肺炎克雷伯菌根据其毒力和对抗菌药物耐药性的不同可分成两大类，一大类是毒力低、耐药率高为特点的经典KP（classic Klebsiella pneumoniae，cKP），另一大类是毒力高、耐药率低为特点的高毒力KP（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HvKP）[13]。高黏液是HvKP最重要的特征之一，所以许多研究把拉丝试验阳性的KP定义为HvKP，因为它会导致免疫力健全人群的社区获得性感染，最容易引起肝脓肿，并因其高毒力导致较高的致死率。本研究中HmKP占36.00%，与Zhang等[14]研究的血流感染、医院获得性肺炎和腹腔内感染等综合来源的37.8%相近，低于王丽萍等[5]报道腹腔感染单一来源的51.19%，可能是由于地区间差异，也可能是HmKP更容易侵入机体特定部位脏器导致，其原因还需要进一步验证。

隨着当前抗生素的普遍应用，多重耐药KP、耐碳青霉烯KP均有大量报道，对临床抗菌方案的选用提出了巨大的考验。但本研究中，KP对常见的抗菌药物敏感性较高，可能跟本研究人群社区获得性有关，与医院获得性的高耐药率显著不同，同时可能受地区耐药率的影响。研究中仅发现一株对6种抗生素均不敏感的cKP，并通过全基因组分析，发现该菌株携带β-内酰胺类耐药基因（blaCTX-M和blaSHV），喹诺酮耐药基因（qnrS），磺胺类耐药基因（sul1），外排泵基因（baeR、oqxA、emrR和marA）和膜孔蛋白基因（ompK37）等。

肺炎克雷伯菌已成为一个紧迫的公共卫生威胁，因此强有力的流行病学监测至关重要。此细菌产生的荚膜多糖是重要的毒力因子和流行病学标记物，全基因组序列为探索荚膜多样性提供了前所未有的机会。目前有报道[15]可能多达134个不同的K型，其中K1、K2、K5、K20、K54和K57是HmKP的独特K型。本研究中K1型占显著优势，其次为K57、K2、K9、K54、K63型，表明本地区糖尿病患者肠道携带的HmKP存在K1型优势菌株，而cKP的K型分散明显，未发现集中趋势。毒力基因多位于染色体上，其编码的毒力因子，是决定KP侵袭能力以及对抗菌药物敏感性的重要因素，包括荚膜、脂多糖、铁载体和菌毛等。本研究中的50株KP检测到多种毒力基因并呈现多样性，49株携带与菌株黏附相关的3型菌毛mrk基因，并发现HmKP与非HmKP在毒力基因all、arc、clb、fdr、fyu、glc、glx、hyi、iro、irp、iuc、iut、mce、rmpA、rmpA2、ybb、ybt和ylb的携带率差异均有统计学意义，HmKP可能携带更多毒力基因，导致多样化的侵袭性感染。位于KP染色体上的kfu基因编码相应蛋白，可以介导Fe3+的吸收从而增加KP毒力[16]，胡仁静等[17]报道仅在K1血清型KP中检出kfu基因，Lee等[18]对分离自肝脓肿患者的14株K2血清型KP的研究结果显示，其中有35.7%的菌株携带该基因。与以往报道不同，本研究中不仅K1血清型携带kfu基因，K13、K49、K54、K57血清型也携带该基因。

同时，在抗生素压力下，菌株由于适应性需求，高毒力高耐药的肺炎克雷伯菌也出现越来越多的报道[19-20]。多位点序列分型是通过检测核酸序列而划分细菌类型的方法，可以较好地表现细菌地区进化过程和菌群生物学变化，可以分析不同ST型在一个区域内的局部传播趋势，有利于对细菌进行短期和长期的流行病学研究。本研究发现本地糖尿病患者肠道中ST23型KP占比最高，ST23是HmKp中的优势菌株之一，值得注意的是，ST23与荚膜血清型K1紧密相关，这与中国东南部Zhang等[21]发现的化脓性肝脓肿中KP菌株的分子流行病学特征相一致，进一步支持了引起侵袭性肝脓肿的KP来源于肠道的观点。一旦糖尿病患者免疫力降低或者肠道保护屏障损伤，KP便有可能逆行侵入门脉系统，引起肝脓肿或者远处播散感染其他器官。同时本研究发现ST412与K57血清型紧密相关，与国内外报道临床标本检出KP中的发现相一致[17， 22]。此外本研究中ST22与K9血清型紧密相关，ST111与K63血清型紧密相关，但可能由于对非高毒力KP相关研究甚少，未发现相关报道，但这些发现都揭示了ST分型与荚膜血清型的紧密相关性。

综上所述，烟台地区糖尿病患者肠道中肺炎克雷伯菌当前定植率较高，耐药率较低，高黏液表型KP携带更多的毒力基因，K1-ST23菌株已初步占优势，有进一步传播流行的可能性，应高度关注对糖尿病患者等易感人群的监测，以便预防肺炎克雷伯菌所引起的感染。

参 考 文 献

Duan T. Analysis of microbiological and clinical characteristics of bacterial infection in patients with pulmonary infection[J]. Comput Intell Neurosci， 2022： 5607358.

Yen T H， Lai C H， Tsai M K. Klebsiella pneumoniae liver abscess with intracerebral hemorrhage[J]. Clin Gastroenterol Hepatol， 2022， 20（7）： e1521-e1522.

Yang G， Huang X， Jiang S， et al. Endogenous endophthalmitis caused by Klebsiella pneumoniae： A ten-year retrospective study in Western China[J]. Ophthalmic Res， 2020， 63（5）： 507-516.

Zhang R， Liu L Z， Zhou H W， et al. Nationwide surveillance of clinical carbapenem-resistant  Enterobacteriaceae （CRE） strains in China[J]. E Bio Medicine， 2017， 19： 98-106.

王丽萍， 邵春红， 范会， 等. 腹腔感染高毒力肺炎克雷伯菌的临床与分子特征分析[J]. 检验医学与临床， 2022， 19（22）： 3050-3054.

钱荣立. 关于糖尿病的新诊断标准与分型[J]. 中国糖尿病杂志， 2000（1）： 4-5.

胡付品， 郭燕， 朱德妹， 等. 2021年CHINET中国细菌耐药监测[J]. 中国感染与化疗杂志， 2022， 22（5）： 521-530.

Aguilar-Zapata D， Duran-Bedolla J， López-Jácome L E， et al. Klebsiella pneumoniae K2 producer of pyogenic liver abscess associated with biliary communication[J]. J Infect Dev Ctries， 2022， 16（9）： 1524-1529.

Fung C P， Lin Y T， Lin J C， et al. Klebsiella pneumoniae in gastrointestinal tract and pyogenic liver abscess[J]. Emerg Infect Dis， 2012， 18（8）： 1322-1325.

范沁榕， 沈兰凤， 胡仁静. Wzi测序在粪便携带肺炎克雷伯菌的血清型检测中的应用[J]. 临床与病理杂志， 2020， 40（11）： 2844-2850.

Zhang X， Wang L， Li R， et al. Presence and characterization of Klebsiella pneumoniae from the intestinal tract of diarrhoea patients[J]. Lett Appl Microbiol， 2018， 66（6）： 514-522.

吴家睿. 从糖化血红蛋白控制标准的争论看糖尿病控制：兼论2017年版《中国2型糖尿病防治指南》[J]. 中华糖尿病杂志， 2018， 10 （5）： 318-321.

Russo T A， Marr C M. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae[J]. Clin Microbiol Rev， 2019， 32（3）： e00001-19.

Zhang Y， Zhao C， Wang Q， et al. High prevalence of hypervirulent Klebsiella pneumoniae infection in China： Geographic distribution， dlinical characteristics， and antimicrobial resistance[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2016， 60（10）： 6115-6120.

Wyres K L， Wick R R， Gorrie C， et al. Identification of Klebsiella capsule synthesis loci from whole genome data[J]. Microb Genom， 2016， 2（12）： e000102.

Hsieh P F， Lin T L， Lee C Z， et al. Seruminduced iron-acquisition systems and TonB contribute to virulence in Klebsiella pneumoniae causing primary pyogenic liver abscess[J]. J Infect Dis， 2008， 197（12）： 1717-1727.

胡仁静， 汤怡颖， 胡锡池， 等. 肝脓肿相关肺炎克雷伯菌毒力基因检测及同源性分析[J]. 临床检验杂志， 2018， 36（4）： 263-266.

Lee I R， Molton J S， Wyres K L， et al. Differential host susceptibility and bacterial virulence factors driving Klebsiella liver abscess in an ethnically diverse population[J]. Sci Rep， 2016， 6： 29316.

Yang X， Dong N， Chan E W， et al. Carbapenem resistance-encoding and virulence-encoding conjugative plasmids in Klebsiella pneumoniae[J]. Trends Microbiol， 2021， 29（1）： 65-83.

李春梅， 王城城， 范永秀， 等. 老年重癥患者肠道定植产KPC-2肺炎克雷伯菌的分子流行病学特征[J]. 中华医院感染学杂志， 2022， 32（16）： 2401-2405.

Zhang S， Zhang X， Wu Q， et al. Clinical， microbiological， and molecular epidemiological characteristics of Klebsiella pneumoniae-induced pyogenic liver abscess in southeastern China[J]. Antimicrob Resist Infect Control， 2019， 8： 166.

Wei D D， Xiong X S， Mei Y F， et al. Microbiological and clinical characteristics of Klebsiella pneumoniae isolates of K57 capsular serotype in China[J]. Microb Drug Resist， 2021， 27（3）： 391-400.