类鼻疽实验室诊断的研究进展*

许珊珊，陈鑫苹，肖 斌 综述，符生苗△ 审校

1.海南医学院附属海南医院医学检验中心,海南海口 570311；2.海南省肿瘤医院检验科/海南热带肿瘤研究所，海南海口 570312；3.广州医科大学附属第六医院/清远市人民医院检验医学部,广东清远 511518

类鼻疽伯克霍尔德菌(Bp)是一种引起类鼻疽病的高致病性细菌，主要流行于东南亚及澳大利亚北部。近些年非流行地区零星报道病例增多，据估计，类鼻疽病每年造成的全球疾病负担约为165 000例，其中89 000例死亡[1]。类鼻疽感染与职业及自身基础疾病存在相关性。在高危人群中糖尿病为关联性最强的易感因素，超过50%的类鼻疽患者都存在糖尿病[2-3]。类鼻疽平均潜伏期为9 d，但也有感染长达20年后发病，即所谓“潜伏型类鼻疽”。其临床表现差异大，包括皮肤和软组织脓肿、肺炎和感染性休克，后者的病死率超过80%，一半的类鼻疽死亡发生在就诊后的前48 h内[4]。由于缺乏快速的实验室诊断方法，只能通过临床症状及流行病学史经验性地进行靶向治疗。该细菌对多种抗菌药物存在天然耐药，使用无效的抗菌药的治疗可能导致病死率(CFR)超过70%。面对非特异性的临床表现，及早诊断显得尤为重要，故本文将对类鼻疽的实验室诊断方法进行介绍。

1 分离培养法

当前诊断类鼻疽的金标准仍是细菌培养。将被正常菌群污染的样本接种到选择性培养基(如Ashdown琼脂或洋葱伯克霍尔德菌琼脂)上，提高了被正常菌群污染的标本中Bp检出率[5]。培养法需要经验丰富的微生物学家和严格的实验室安全程序，耗时长、灵敏度差、阳性率低、早期诊断易漏诊。使用生化表型鉴定系统进行识别诊断的准确性约为80%，VITEK 2系统常将Bp误认为洋葱伯克霍尔德菌，且该系统在属级水平上的错误识别率很高。API 20NE系统具有明显的地域差异，Bp通常被错误鉴定为洋葱伯克霍尔德菌或紫色色杆菌，且该系统需要至少24 h才能得出结果，作为筛选方法不太令人满意[6-7]。

2 血清学检测

血清学检测易于执行且价格低廉，可以减少实验室诊断的时间。即时诊断是早期诊断的关键，近些年正在开发和评估越来越多的非培养类鼻疽快速诊断技术，血清学检测用于开发即时诊断具有更广阔的前景。目前血清学检测主要包括间接血凝试验(IHA)[8]、乳胶凝集试验(LAT)[9-10]、免疫荧光分析(IFA)[11-12]、快速免疫色谱检测(ICT)[13]、酶联免疫吸附试验(ELISA)、侧向流动免疫测定法(LFI)[14]和蛋白质微阵列技术[15]等。

IHA由于灵敏度不高，且对感染铜绿假单胞菌患者检测结果存在假阳性，因此该方法仅用于没有类鼻疽流行地区居住史并且曾进行过一次或少量离散到访而可能发生暴露的旅行者。LAT与泰国伯克霍尔德菌和洋葱伯克霍尔德菌产生交叉反应，只能作为一种初筛试验[10]。虽然IFA法具有较佳的灵敏度(92.6%)及特异度(100.0%)但不能直接检测全血或血清样本，且对设备及人员有较高的要求，适合在初筛的基础上使用该方法作为判断依据。ICT检测的是溶血素共调节蛋白(Hcp1)的IgG抗体，其操作简便、耗时短，可用于流行病学调查及现场诊断。虽然Hcp1已被证实是宿主体液免疫反应的重要靶标，但在免疫功能低下或诊断时间过早时均有可能出现假阴性[16]。针对性地检测Hcp1的IgM是否会提高类鼻疽诊断的灵敏度和特异度，或运用Hcp1的IgG和IgM能否可靠区分现症感染与既往感染有待进一步研究。

外膜蛋白(ompA)[17]、伴侣蛋白(rGroEL)[17]、荚膜多糖(CPS)[18]、O-多糖(OPS)[18]、鞭毛蛋白(FLAG300)、Hcp1[19]等是常用的Bp抗原，其中Hcp1及OPS是开发快速即时检测的具有前景的候选靶抗原。处在流行地区的人群血清背景阳性率高，rGroEL在健康人群中表现出较少的抗体反应，这一特征使其应用在流行地区具有很高的阴性预测价值，但与假单胞菌属和其他非发酵革兰阴性杆菌(GNF)存在交叉反应，需要进一步优化抗原以提高检测的准确性。免疫磁珠(IMB)联合ELISA(IMB-ELISA)的方法灵敏度低，耗时久且与大肠杆菌显示出模糊的交叉反应故不推荐使用[20]。单独应用LFI检测类鼻疽灵敏度不高，CPS-LFI和Hcp1-ELISA或OPS-ELISA联合诊断类鼻疽，可提高检测的灵敏度[21]。InBios公司开发的横向流动检测法(AMD-LFI)在检测尿液样本时显示假阳性结果，考虑是源于尿液中的CPS负荷低，可使用尿液浓缩器提高AMD-LFI的灵敏度[22-23]，随后优化出AMD-Plus检测系统，测试中未出现早期的假阳性尿带[24]。Bp CPS半衰期短且可快速排泄至尿液，使用尿液检测的AMD-LFI阳性可提示活动性的类鼻疽感染，根据这一特点，持续性检测AMD-LFI可监控患者病情进展及用药疗效。

基于20种类鼻疽抗原开发的蛋白质微阵列是对类鼻疽患者血清中短期和长期抗体的多重检测[15]。其灵敏度(86.7%)明显高于IHA(57.3%)。标准化的微阵列装置简单、检测方便、速度快，适于常规诊断实验室应用。

3 分子生物学检测

由于血清学检测方法依赖于抗体滴度，灵敏度及特异度不稳定。鉴于病原体检测的研究热点应是开发更加简便的分子生物学检测方法，缩短检测时间且不影响检测结果的准确性。

3.1聚合酶链反应(PCR) 目前PCR常用靶标Ⅲ型分泌系统研究基因簇(TTS1)内orf2，最常见的是通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法直接从临床样本中检测病原体，qPCR是当前定量最准确、重复性最好的核酸检测技术。ZUETER等[25]运用TTS1基因簇中的orf1-stcQ作为PCR扩增的靶标，检测菌株的灵敏度和特异度均为100.00%，血培养中的检测限为18.4×105CFU/mL。但是基于单基因检测会出现假阴性结果，开发多基因多重靶点检测可以提高灵敏度。SEMAIL等[26]首次筛选Bp的6型分泌系统5(T6SS-5),建立了测定7种基因(tss C-5、tag D-5、tss A-5、hcp -5、tss B-5、tss F-5和vgrG-5)的多重PCR检测方法。经优化后临床分离株的灵敏度为93.80%，特异度为100.00%。7种基因中除tss F-5检出限为105CFU/mL外，其他靶标基因均能检测到103CFU/mL，这与RPA的灵敏度相当。该多重PCR技术不仅可以应用于类鼻疽的实验室诊断，同时能进一步了解Bp的毒力机制，对类鼻疽的治疗提供新的思路。由于该方法未对临床样本进行检测，尚不能确定是否所有的Bp都存在T6SS-5基因，对其实际应用的可能性需进一步评估。

等温热隔绝式聚合酶链式反应(iiPCR)是一种基于荧光水解探针的低成本的对流PCR，该方法已被开发应用于检测疟疾[27]、登革热病毒[28]等。CHUA等[29]开发的针对靶标bimA基因的iiPCR表现出高度特异度(100.00%)及灵敏度(97.52%)，检测限为14 ng/μL，bimA在鼻疽伯克霍尔德菌及泰国伯克霍尔德菌中存在明显差异，这对于区分与Bp密切相关的伯克霍尔德菌属具有极大的价值。便携的核酸分析仪可利用电池供电，适用于现场诊断。由于该方法检测的伯克霍尔德菌属菌株数量有限，且未对洋葱伯克霍尔德菌进行鉴定，未来应进一步证实iiPCR的特异度。

3.2环介导等温扩增(LAMP) CHANTRATITA等[30]以TTS1基因簇为靶点的环介导等温扩增法检测类鼻疽，结果表明LAMP比qPCR的灵敏度更高,检测限达到38 拷贝/反应，如将LAMP与纳米生物传感器(LFB)结合可更便捷地读取结果[31]。TZELING等[32]使用两组不同的引物和特定双功能寡核苷酸(DFO)建立了一种多重实时LAMP检测，可同时检测类鼻疽和恶性疟原虫。DFO-LAMP检测的DNA的最小浓度为1 fg，比传统的多重LAMP(10 fg/μL)更敏感，且未发生交叉反应，特异度为100.00%。因此，多重LAMP为核酸诊断技术提供了一种简便、可靠、快速、高度灵敏和特异度的方法。

3.3重组酶聚合酶扩增(RPA) RPA能够在25～50 ℃的温度范围内将DNA扩增至可检测水平，在低资源环境现场应用是一个很大的优势。PENG等[33]通过靶向TTS1-orf2基因建立重组酶聚合酶扩增技术结合横向流动试纸检测法(LF-RPA)，LF-RPA和qPCR检测临床样本的检测限均为4.2×103CFU/mL，且LF-RPA对血液中的抑制剂更具耐受性。SAXENA等[34]使用Bp菌株K96243的BPSS1399上游的DNA序列(251 bp)作为靶标序列，在血液和尿液样本中检测限为4.8×104CFU/mL和4.95×104CFU/mL，与先前的LF-RPA相比表现更佳。气溶胶污染是困扰核酸检测的一大难题，在操作时应严格分区，否则容易造成假阳性，LI等[35]和ZHAO等[36]不仅开发了一种简便可视装备与LF-RPA相结合既能减少假阳性，而且引物经优化后的检测结果更好，与实时PCR具有相同的灵敏度，与16S rRNA基因测序结果无显著差异，具有高度特异度(100.00%)。与LAMP相比，RPA的引物设计较为简便。由此可见，LF-RPA是当今基于PCR技术检测类鼻疽的替代方法。

3.4多重交叉置换扩增(MCDA) WANG等[37]将MCDA技术与基于纳米颗粒的生物传感器(NB)相结合，在纯培养物DNA的检测限为10 fg，特异度为100.00%，且经临床样本评估MCDA-NB的诊断准确性与金标准培养法相符合。MCDA-NB无需使用特殊的仪器设备便可快速获取结果，对于基层及现场应用具有极大帮助。

3.5基因测序 16S rRNA基因序列可以有效区分类鼻疽和鼻疽。对于Bp与泰国伯克霍尔德菌，groEL基因核苷酸序列显示<97.6%的同一性，具有更高的鉴别价值[38]。全基因测序不仅可以准确鉴别类鼻疽，及时发现突变的细菌，有效指导临床治疗，还可用于寻找传染源、传播途径，预测疾病传播风险，在流行病防控方面具有重要意义[39]。

3.6自动化分子诊断平台 GASSIEP等[40]首次使用Panther fusion自动化分子诊断仪器直接检测全血样本中的Bp，检测限为1.64×103CFU/mL，但由于灵敏度较低，该方法仅适用于血培养阳性诊断。自动化分子诊断平台可以有效降低劳动成本、处理样本时间、样本污染风险，未来可以寻找其他的分子靶点以提高检测的灵敏度。

4 其他检测方法

4.1质谱法 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)可以准确地鉴定Bp并区分其他的伯克霍尔德菌属，也可用于流行病学研究，对Bp及其相关物种的发现和分布，还能区分野生型和突变体。MALDI-TOF MS在澳大利亚和中国的研究具有良好的灵敏度和特异度[41-42]，但由于Bp存在较高的遗传多态性，为了进一步评估MALDI-TOF MS的准确性，WATTHANAWORAWIT等[43]在RUO模式下使用Vitek MS创建用于Bp鉴定的超光谱，并针对来自类鼻疽流行的3个国家的分离株进行研究，结果显示来自东南亚和澳大利亚的分离株100.0%能正确识别。MALDITOF-MS鉴定的准确性取决于数据库的信息量，需要不断完善相关数据库以提升微生物鉴定在临床中的诊断价值。

4.2上转发光免疫层析法(Bps-UPT-LF) 利用上转发光材料结合双抗体夹心法制备出Bps-UPT-LF类鼻疽检测试纸，该技术灵敏度高，且对104～107CFU/mL的Bp可进行精准定量[44]。基于Bps-UPT-LF试纸耐受性强、操作简便、快速，运用于现场环境检测更有优势。

4.3支持向量机(SVM) 研究发现中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞水平的变化与类鼻疽发生和发展密切相关[45]。鉴于以上特点，XU等[46]建立了由CD8+T细胞、静息CD4+记忆T细胞、单核细胞、M2巨噬细胞和活化肥大细胞组合而成的新型SVM模型用于检测败血症性类鼻疽。该方法的成本相对较低，表现出高度特异度及灵敏度，可以作为改进类鼻疽检测和诊断的补充。

5 结语与展望

随着人口和病原体的移动增加了新地区流行的风险，类鼻疽的全球负担不断增加。对类鼻疽的诊断不应局限于临床样本，环境样本也应纳入考虑，对环境进行检测可以扩大类鼻疽的全球风险图，有效监控疾病的发生。预防和降低受影响个体的死亡率是类鼻疽研究的两个关键课题。快速实验室诊断有助于早期使用恰当的抗菌药物进行治疗，从而可能降低因延迟治疗而导致的死亡率。实现对类鼻疽的早期发现、早期诊断、早期治疗是当前及未来的努力目标。由于目前还没有市售且可靠的类鼻疽即时诊断技术，因此开发简便、灵敏，能够快速识别分离株并直接检测临床标本的诊断方法是未来主要的研究方向，其中，优化出简便的分子生物学方法将对类鼻疽流行地区和资源匮乏地区的病情进行监控，提供有效治疗，遏制疾病的蔓延均有极大的帮助。