1例疑难血型的血清学和基因定型处理体会

李雪晨,王加勇,陆紫敏,方 琦,郑 浩,周 涛,丁 懿

同济大学附属同济医院输血科，上海 20065

输血在临床救治患者中起着关键作用，血型鉴定正确是保证临床输血安全的重要前提。患者在输血前进行血型鉴定，通过正反定型一致确保ABO血型准确，但病理条件下，尤其是恶性血液病患者，血型抗原缺失或表达减弱，会发生血型鉴定困难[1]。抗-M是MSN血型系统常见抗体，抗-M会引起ABO血型鉴定困难与交叉配血不合，影响输血[2]。本实验室使用血型血清学和聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法处理了1例同时存在上述2 种情况的患者，报道如下。

1 资料与方法

1.1病历资料 患者，女，65岁，汉族，因头晕乏力，胸闷气促，于2021年11月8日夜间到本院急诊内科就诊。患者在外院确诊为多发性骨髓瘤1年半，重度贫血貌，胸闷，明显气促，心率114次/min，显著增快，双肺呼吸音粗，左侧呼吸音减弱，行胸部CT检查提示双肺感染。急诊查血常规，白细胞计数(WBC)为3.05×109/L，血红蛋白浓度(Hb)为31 g/L，红细胞计数(RBC)为1.02×1012/L，血小板计数(PLT)为52×109/L，患者严重贫血，急诊申请输注红细胞悬液4个单位。因患者ABO血型鉴定正反定型不一致，患者急需输血，输血科启动紧急用血应急预案进一步处理。

1.2仪器与试剂 ABO/Rh(D)血型定型检测卡(西班牙GRIFOLS，批号21007.01)，不规则抗体筛检卡(西班牙GROFOLS，批号21094.01)，凝聚胺试剂(珠海贝索，批号A201205)，抗A/抗B血型定型试剂(长春博得，批号20210605)，RhD(IgM)血型定型试剂(长春博得，批号SY20210201)，抗人球蛋白(抗IgG，C3d)检测试剂(上海血液生物，批号20205001)，ABO血型反定型试剂(红细胞，长春博得，批号20210920)，不规则抗体检测试剂(红细胞，长春博得，批号是20210918)，抗体鉴定谱细胞(上海血液生物，批号20210924)，抗-M、抗-N血型定型试剂(上海血液生物，批号20210608)，红细胞ABO血型基因分型试剂盒(天津秀鹏生物，202004001)，核酸提取或纯化试剂(天津秀鹏生物，202108003)，PCR仪(杭州博日，Life ECO)，核酸电泳仪(北京君意，JY300C)，核酸成像分析仪(北京君意，JYO2S)，全自动配血及血型分析仪(西班牙GRIFOLS，WADiana)，细胞洗涤离心机(日本久保田，KA-2200)，离心机(日本久保田，2420型)，三用电热恒温水箱(常州翔天，XMTD-204)，冰箱(青岛Haier，HYCD-205)。

1.3方法

1.3.1PCR-SSP法检测 患者签署同意书后，取新鲜EDTA抗凝全血2 mL，用核酸提取或纯化试剂从全血中提取DNA，采用紫外分光光度计检测DNA含量为20.39 ng/μL，A260/A280比值为1.76。采用PCR-SSP法检测ABO血型基因，PCR反应体系总体积120.9 μL，其中0.9 μL Taq酶(5 units/μL)，10 μL DNA(22 ng/μL)，110 μL dNTP-Buffer工作液，分别向红细胞ABO血型基因分型试剂盒的引物孔(1～11孔)中各加入10 μL上述混合液。调整好反应程序，置Life ECO型PCR仪上进行扩增。PCR反应条件为：在96 ℃预变性2 min，进入循环扩增阶段，96 ℃ 20 s，68 ℃ 60 s，循环5次；96 ℃ 20 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循环10次；96 ℃ 20 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循环15次；72 ℃ 3 min；最后在4 ℃条件下保存。将PCR产物转移至2.5%琼脂糖凝胶孔中，JY300C核酸电泳仪电泳15 min，在JYO2S核酸成像分析仪下观察条带结构，依据结果分型表判断血型检测结果。

1.3.2血清学试验 ABO/Rh血型鉴定、不规则抗体筛查采用微柱凝胶卡法和试管法，抗体鉴定谱细胞检测采用试管法，交叉配血联合采用盐水试管法、聚凝胺法和抗球蛋白柱凝集法，Rh分型、直接抗人球蛋白试验(DAT)采用试管法。实验操作均按照标准操作规程执行[3]。

1.3.3吸收试验 将3人份O型Rh阳性MN表型为MM的献血员红细胞混合，用生理盐水将上述红细胞洗涤3次，取1 mL压积红细胞，加入等量患者血清，4 ℃吸收2 h，每30 min摇动1次，用离心获得的患者血清吸收液进行ABO血型鉴定。

2 结 果

2.1血型鉴定与抗体筛查 患者ABO血型鉴定结果见表1，正定型结果为Aweak，反定型结果为O型，试管法反定型在显微镜镜下可见A1红细胞凝集，加生理盐水后凝集未散开，正反定型结果不一致；患者Rh血型是DCCee。患者血浆与抗体筛查细胞Ⅰ和筛查细胞Ⅱ凝集，结果见表2。患者红细胞做直接抗球蛋白试验(DAT)结果为阴性。

表1 患者ABO血型鉴定正反定型结果

表2 患者不规则抗体筛查结果

2.2PCR-SSP法检测 ABO基因分型结果见图1，患者基因型为AO1，表型为A型。

图1 PCR-SSP法检测ABO基因分型结果

2.3抗体鉴定 患者血清与抗体鉴定谱细胞反应，格局为1、2、5、6、8和10号细胞均1+，3、4、7和9号细胞均阴性，自身红细胞对照阴性。对照谱细胞试剂盒(上海血液生物，批号20210924)抗原格局表，判定患者体内存在抗-M抗体。红细胞血型抗体鉴定细胞反应格局表见表3。

表3 红细胞血型抗体鉴定细胞反应格局表

2.4吸收试验 冷吸收后患者ABO血型鉴定试管法结果见表4，ABO血型为A型，正反定型一致，证实抗-M抗体存在。

续表3 红细胞血型抗体鉴定细胞反应格局表

表4 冷吸收后患者ABO血型鉴定结果

2.5交叉配血 与4个单位M抗原阴性的A型Rh分型为DCCee的红细胞做交叉配血试验，主侧和次侧在盐水、凝聚胺及抗球蛋白介质中均无聚集，无溶血。患者当天夜间输注上述4 U去白细胞悬浮红细胞后，血红蛋白由输血前31 g/L上升到60 g/L，红细胞计数由输血前1.12×1012/L上升到2.17×1012/L，证明输血有效。

3 讨 论

在临床输血治疗过程中，正确的血型鉴定是确保输血安全的首要条件。近年来，分子生物学法在ABO疑难血型鉴定中被广泛应用[4]。开展疑难ABO血型基因分型检测，与血清学鉴定技术相结合，可以快速、准确地鉴定出疑难ABO血型，顺利解决疑难血型鉴定的问题。

该患者的血型鉴定试验中，反定型试管法A1c、Oc在不同温度条件下凝集强度一致，排除是由于冷凝集素干扰引起的正反定型结果不一致[5]。该病例为多发性骨髓瘤患者，考虑可能存在大量异常血浆蛋白干扰，反定型A1c加1滴0.9%生理盐水混匀，在显微镜镜下观察凝集未消失，排除是由于血浆蛋白异常引起的假凝集[6]。该病例与A亚型的血清学典型特征类似，正定型中红细胞与抗-A发生弱凝集(+1)，在反定型中与健康者的A1红细胞发生弱凝集(+1)，疑似为A亚型[7]，本实验室选择PCR-SSP法检测ABO血型基因。

该患者ABO基因分型为AO1，表型为A型，可排除ABO亚型，患者正定型结果为Aweak，有文献报道，ABO抗原减弱常见于恶性白血病，尤其在急性髓细胞白血病多见，其次是骨髓增生异常综合征，与本病例相符[8]。该患者血清只与抗体筛查细胞Ⅰ、Ⅱ反应凝集，不是与3个抗体筛查细胞均反应凝集，且患者直接抗球蛋白试验结果为阴性，可排除是由于自身抗体存在造成的血型定型困难[9]。本实验室选择对患者进行抗体鉴定，依据谱细胞筛查结果，判定患者体内存在抗-M抗体。虽然患者反定型中未出现O细胞凝集现象，但吸收试验结果证实了抗-M抗体的存在，也有效消除抗-M抗体对血型鉴定的干扰，确认患者ABO血型为A型，给患者输注4单位M抗原阴性的A型悬浮红悬液后，患者红细胞总数和血红蛋白均上升，输血有效。

本实验室认为输血科在临床输血实践中，开展血型基因分型检测，可以作为血清学方法的有效补充，能在疑难血型的诊断中发挥重要作用，也能大大减少急诊患者用血等待时间，为临床输血二级学科发展注入动力，保障临床用血安全、合理、有效。