正交试验优化二丁口服液提取工艺

康玉霞，王 欣，王亚丽，崔小七，陈长青，郭玉凡

(郑州百瑞动物药业有限公司，河南 郑州 450000)

二丁口服液主要由紫花地丁、蒲公英、半边莲、板蓝根四味药材组成，方中紫花地丁、蒲公英苦寒，清热解毒，消痈，为君药；板蓝根解毒利咽，消肿，为臣药；半边莲甘淡渗利，为佐使，可使热随体液而出，又兼具消肿解毒之功效。诸药合用，力专而雄，实为清热解毒之重剂。现代药理学研究表明，紫花地丁具有抑菌、抗炎、抗病毒、调节免疫等作用[1]，蒲公英具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、调节免疫等作用[2]，半边莲具有抑菌、镇痛抗炎、抗氧化等作用[3]，板蓝根具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗病原微生物、提高机体免疫力等作用[4]；方中各味药材通过配伍，相辅相成，不仅能够直接杀灭病毒和细菌等病原体，还能扶助正气、调节机体免疫功能，通过扶正祛邪、标本兼顾，用于治疗火热毒盛所致的热疖痈毒、咽喉肿痛、风热火眼。为尽可能提取药材中的有效成分，本研究通过正交试验设计优化二丁口服液的提取工艺，以液料比、提取次数和提取时间等因素为考察对象，以干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的综合考察为评价指标，对处方的提取参数进行筛选，优选出最佳提取工艺，以期为二丁口服液的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 秦皮乙素(批号：110741-201708，纯度：99.9%)和咖啡酸(批号：110885-201703，纯度：99.7%)，均购自中国食品药品检定研究院；紫花地丁、半边莲、蒲公英和板蓝根，均购自河南禹州药材市场，经检验均符合2020版《中华人民共和国药典》该药材项下的有关规定；纯化水，本实验室自制；分析纯甲醇，购自天津市富宇精细化工有限公司；色谱纯甲醇，购自天津市精细化学品有限公司。

1.2 主要仪器 DZKW-4型水浴锅(北京中兴伟业世纪仪器有限公司)；LC-1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备长厂)；十万分之一分析天平(MS205DU，梅特勒-托利多)；TD5Z低速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 二丁口服液提取液的制备 分别称取处方量的紫花地丁、蒲公英、半边莲和板蓝根，加12倍量水加热提取2次，每次1 h，滤过，滤液合并，浓缩，离心，上清液制成1 g/mL的药液，备用。

1.3.2 干膏得率 精密吸取1.3.1中制备药液10 mL置于干燥至恒重的蒸发皿中，蒸干，105 ℃烘箱干燥4 h至恒重，取出，迅速置干燥器中冷却至室温，称重，按公式(1)计算干膏得率(%)[5]。

(1)

1.3.3 含量测定 采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)进行含量测定，并进行方法学验证。色谱条件：色谱柱：ODS2 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸(20∶80，v/v)；流速：1.0 mL/min；检测波长：324 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在此条件下，秦皮乙素、咖啡酸与其他组分均有较好的分离，理论塔板数按各峰计算，均不低于3 000。

1.3.3.1 对照品溶液的制备 精密称取秦皮乙素对照品18.62 mg，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.93 mg/mL的对照品储备液。精密吸取该对照品储备液3.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.33 mg/mL的秦皮乙素对照品溶液。精密称取咖啡酸对照品11.85 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，得质量浓度为472.58 μg/mL的对照品储备液。精密吸取该对照品储备液1.0 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得质量浓度为18.90 μg/mL的咖啡酸对照品溶液。

1.3.3.2 供试品溶液的制备 精密吸取1.3.3.1中制备的药液5 mL，置150 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，摇匀，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.3.3 阴性对照溶液的制备 取紫花地丁、蒲公英阴性样品适量，按1.3.3.2项下的方法制备阴性对照溶液。

1.3.3.4 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按1.3.3项下的色谱条件进样测定。

1.3.3.5 线性关系考察 精密量取秦皮乙素对照品储备液0.35、0.70、1.00、1.40、1.80、2.10和2.50 mL，分别置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.065、0.130、0.186、0.260、0.335、0.391和0.465 mg/mL的秦皮乙素对照品系列溶液。精密量取咖啡酸对照品储备液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20和1.40 mL，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度为3.78、7.56、11.34、15.12、18.90、22.68和26.46 μg/mL 的咖啡酸对照品系列溶液。精密吸取秦皮乙素和咖啡酸对照品系列溶液各10 μL，按照1.3.3项下的色谱条件进样测定，记录峰面积。以各对照品的峰面积(Y)对其进样质量浓度(X)进行线性回归，计算线性回归方程。

1.3.3.6 精密度试验 按照1.3.3项下的色谱条件，精密吸取对照品溶液各10 μL，重复进样6次，记录峰面积，计算秦皮乙素和咖啡酸的RSD值。

1.3.3.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，在0、2、4、6、8、10和12 h，按照1.3.3项下的色谱条件，分别进样测定，记录峰面积，计算秦皮乙素和咖啡酸的RSD值。

1.3.3.8 重复性试验 取同一批药液，按照1.3.3.2项下的方法，制备6份供试品溶液，并按照1.3.3项下的色谱条件，分别进样测定，记录峰面积，计算秦皮乙素和咖啡酸的平均含量和RSD值。

1.3.3.9 加样回收率试验 精密量取1.3.3.8中药液2.5 mL共6份，加入一定量的秦皮乙素和咖啡酸对照品储备液，加甲醇18 mL，密塞，摇匀，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取10 μL，按照1.3.3项下的色谱条件进样测定，计算加样回收率。

1.3.3.10 检测限 按信噪比3∶1为标准，精密称取秦皮乙素、咖啡酸对照品适量，加甲醇分别配制成相应的浓度，进样检测，分别测定秦皮乙素和咖啡酸的检测限。

1.3.3.11 定量限 按信噪比10∶1为标准，精密称取秦皮乙素、咖啡酸对照品适量，加甲醇分别配制成相应的浓度，进样检测，分别测定秦皮乙素和咖啡酸的定量限。

1.3.4 单因素考察 影响中药制剂提取工艺的因素有很多，但主要影响因素为液料比、提取时间和提取次数。现结合生产实际，分别对每个因素进行考察，以干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸的含量为综合评价指标，以干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的最大值为参照，对数据进行归一化法分析，干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的权重系数分别为0.4、0.3和0.3，按公式(2)计算综合评分[6]。

综合评分=(干膏得率/干膏最大得率)×0.4+(秦皮乙素/秦皮乙素最大值)×0.3+(咖啡酸/咖啡酸最大值)×0.3

(2)

1.3.4.1 液料比 分别称取处方量的药材，按液料比10∶1、12∶1、15∶1、18∶1，加热提取2次，每次1 h，滤过，滤液合并，浓缩，离心，上清液制成1 g/mL的药液，分别测定干膏得率、秦皮乙素和蒲公英的含量，按公式(2)计算综合评分。

1.3.4.2 提取时间 分别称取处方量的药材，按液料比12∶1加水，加热提取2次，每次提取时间分别为1、2和3 h，滤过，滤液合并，浓缩，离心，上清液制成1 g/mL的药液，分别测定干膏得率、秦皮乙素和蒲公英的含量，按公式(2)计算综合评分。

1.3.4.3 提取次数 分别称取处方量的药材，按液料比12∶1，加热提取次数分别为1、2和3次，每次提取1 h，滤过，滤液合并，浓缩，离心，上清液制成1 g/mL的药液，分别测定干膏得率、秦皮乙素和蒲公英的含量，按公式(2)计算综合评分。

1.3.5 正交试验 根据单因素试验和检索相关文献的结果[6，7]，液料比、提取时间和提取次数为影响提取效果的主要因素。因此正交试验选择液料比、提取时间和提取次数3个因素为考察对象，每个因素分别选取3个水平，按L9(34)正交表进行试验，优选最佳提取参数。正交试验采用综合评分的方法，以干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量为综合评价指标，按公式(2)计算综合评分。

1.3.6 工艺验证 称取处方量的药材共50 g，平行称取3份，按照最佳工艺参数进行提取，分别制成3批1 mg/mL的药液，测定干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量，分别对3批药液进行验证。

2 结果

2.1 含量测定

2.1.1 专属性试验 结果显示，供试品溶液和对照品溶液的色谱峰保留时间一致，阴性对照溶液在对照品相应的保留时间均未出现色谱峰(图1)。表明该色谱条件下，秦皮乙素和咖啡酸吸收良好，药液中其他组分对其含量测定均无干扰。

图1 HPLC色谱图

2.1.2 线性关系考察 以各对照品的峰面积(Y)对其进样质量浓度(X)进行线性回归，分别得到秦皮乙素线性回归方程为Y=37 776X+162.95(R2=0.999)(图2)；咖啡酸线性回归方程为Y=57.076X+26.357(R2=0.998 3)(图3)。结果表明，秦皮乙素质量浓度在0.065～0.465 mg/mL、咖啡酸质量浓度在3.78～26.46 μg/mL范围内线性关系良好。

图2 秦皮乙素的标准曲线

图3 咖啡酸的标准曲线

2.1.3 精密度试验 秦皮乙素和咖啡酸RSD值分别为0.41%和0.96%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 秦皮乙素和咖啡酸的RSD值分别为0.89%和1.27%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.5 重复性试验 秦皮乙素的平均含量为1.48 mg/mL，RSD值为1.12%；咖啡酸的平均含量为91.06 μg/mL，RSD值为1.46%。表明该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验 由表1可知，秦皮乙素平均加样回收率99.69%，RSD值为1.72%，咖啡酸加样回收率92.80%，RSD值为1.92%，均符合要求。

表1 加样回收率试验结果

2.1.7 检测限 秦皮乙素的检测限为0.07 μg/mL，咖啡酸的检测限为0.04 μg/mL。

2.1.8 定量限 秦皮乙素的定量限为0.33 μg/mL，咖啡酸的定量限为0.21 μg/mL。

2.2 单因素考察

2.2.1 液料比 由表2可知，随着液料比的增大，干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量随之增加，但当液料比增大到12∶1之后，干膏得率变化不明显，液料比增大到15∶1之后，秦皮乙素和咖啡酸的含量增加幅度较小。

表2 不同液料比对干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的影响

2.2.2 提取时间 由表3可知，随提取时间的增加，干膏得率随之增加，当提取时间增加至2 h后无明显变化，秦皮乙素和咖啡酸的含量随着提取时间的增加略有增加，当提取时间增加至3 h后，咖啡酸含量略有增加，而秦皮乙素含量反而显著下降。

表3 不同提取时间对干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的影响

2.2.3 提取次数 由表4可知，随着提取次数的增加，干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量均随之增加，当提取次数在2次之后，各参数的增加幅度变小。

表4 不同提取次数对干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量的影响

2.3 正交试验 根据单因素试验的结果，正交试验选择液料比(A)、提取时间(B)、提取次数(C)3个因素为考察对象，每个因素分别选取3个水平，依据L9(34)正交表分别进行试验，因素水平见表5。采用正交助手专业版软件进行设计，用方差分析评价各因素水平对提取工艺影响的显著性。正交试验结果见表6，方差分析结果见表7。

表5 L9(34)正交试验因素水平

表6 L9(34)正交试验结果

续表

表7 方差分析

由表6可知，各因素对综合评分的影响依次为C>A>B，即提取次数影响最大，然后是液料比，提取时间对综合评分的影响最小。

由表7可知，提取次数对综合评分的影响具有显著性差异(P<0.05)。根据正交试验结果可知，最佳提取工艺参数为A3B1C3，即液料比为14∶1，提取时间为1 h，提取3次。

2.4 工艺验证 按照最佳工艺参数A3B1C3提取制成3批1 mg/mL的药液，测定干膏得率、秦皮乙素和咖啡酸含量，结果见表8。3批药液的平均干膏得率为31.16%，秦皮乙素的平均含量为1.37 mg/mL，咖啡酸的平均含量为108.14 μg/mL。表明该工艺条件稳定，重复性良好，可用于工业化生产。

表8 验证试验结果(n=3)

3 讨论

关于考察指标的选择，由于紫花地丁和蒲公英同为处方的君药，秦皮乙素是紫花地丁的主要药效成分之一，咖啡酸是蒲公英的主要药效成分之一，而干膏得率又是影响提取效率的重要因素，所以选择三者的综合评分作为提取工艺的考察指标，更加科学、合理。

关于检测波长的选择，秦皮乙素的最大吸收波长为353 nm，咖啡酸的最大吸收波长为324 nm，由于样品中咖啡酸的含量较低，峰面积比较小，为同时兼顾两组分的吸收，选择324 nm为检测波长。

关于流动相的选择，笔者考察了乙腈-0.4%冰醋酸、甲醇-0.4%冰醋酸、甲醇-0.6%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸[8-11]，发现甲醇-0.1%磷酸能把两者较好的分离，且峰形良好。流动相的水相使用冰醋酸溶液时，色谱峰有拖尾现象，有机相选择乙腈时，两组分的分离度不好。

关于供试品溶剂的选择，根据检索相关文献的结果[10-13]，分别考察了50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇和100%甲醇等提取溶剂，结果发现以甲醇为提取溶剂，杂质更少，几种提取溶剂制得的样品，含量相差无几，所以最终选择甲醇为供试品的提取溶剂。

单因素试验结果发现，药液的提取时间超过2 h，秦皮乙素的含量显著降低，可能是由于持续长时间受热导致秦皮乙素化学结构遭到破坏所致。

二丁口服液采用正交试验设计优选出最佳提取工艺，最佳工艺参数为液料比14∶1，提取3次，每次1 h。该提取工艺的综合考察指标明显优于2020版《中华人民共和国药典》二丁颗粒提取工艺的综合考察指标，且该工艺稳定，重复性良好，为二丁口服液的后续开发研究提供了有力的理论基础。