青岛地区3株犬细小病毒全基因组分析

原昆鹏，曲雪婷，孙军昌，王 旭, 齐昊南，陈淑贞，王冬冬，尹 月 ，臧立钰，衣玉颖，刘均华，尹燕博，温建新

(1.青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109 ； 2.青岛市即墨区畜牧业发展服务中心，山东 青岛 266225 ；3.青岛博隆实验动物有限公司，山东 青岛 266225 ； 4.青岛市农业行政执法支队，山东 青岛 266071)

犬细小病毒病是幼犬最危险的传染病之一，受感染犬临床特征是呕吐、发烧、腹泻、出血性肠炎、心肌炎和白细胞减少症[1]。犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的，CPV属于细小病毒科，细小病毒属，是一种无囊膜单股负链DNA病毒[2]。CPV全长约5.3 kb，包括2个主要的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，1个编码结构蛋白VP1和VP2，另1个编码非结构蛋白NS1和NS2[3]。

CPV于1978年首次被发现，为了与犬微小病毒(Minute virus of canine，MVC)区分被命名为CPV-2[4]。1979—1981年发现抗原变异株CPV-2a[5]，1984年变异株CPV-2b被发现[6]。抗原变异株CPV-2c于2000年首次报道[7]。在我国，CPV-2感染于1982年首次被报道[8]，CPV-2a于1986年被报道[9]，CPV-2b出现于1997年[10]，CPV-2c于2010年在吉林省被发现[11]。近年来，new CPV-2a和new CPV-2b开始在中国流行[12]。目前，new CPV-2a和new CPV-2b似乎已经取代了CPV-2a和CPV-2b的原型株，并已成为许多国家的主要流行型[9]。

CPV-2在抗原多样性方面持续增加，其进化速度接近每年每个位点10-4个替代[13]。目前，我国宠物临床CPV防疫多使用进口疫苗，这些进口疫苗均源于原始的CPV-2毒株[14]。本研究从2012—2020年青岛地区使用进口疫苗免疫过的临床CPV发病犬中，先后分离到3株CPV，全基因组序列分析发现，与传统的CPV-2毒株相比，分离毒株已发生较大变异，这可能是导致CPV临床免疫失败的主要原因。

1 材料与方法

1.1 病料采集 青岛市使用进口CPV疫苗免疫过的，临床症状为呕吐、血样腹泻的发病犬，采集新鲜肠道组织作为分离病毒所用病料，低温冻存。采集青岛市使用进口CPV疫苗免疫过的成年健康犬粪便为健康犬对照样品。

1.2 主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清，均购自Cytiva公司；病毒DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、DL-2 000 DNA Marker、DL-5 000 DNA Marker、pMD18-T载体(pMDTM18-T Vector Cloning Kit)、DH5α感受态细胞、PrimeStar HS DNA聚合酶，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 PCR基因扩增仪[TC-96/G/H(b)型]，杭州博日公司产品；电泳仪(JY600E型)、核酸电泳槽(JY-SPFT型)、凝胶成像仪(JY04S-3C型)，君意东方公司产品。

1.4 样品处理 将病料与无菌PBS(pH=7.2)按照1∶5比例混合研磨，反复冻融3次后8 000 r/min 高速离心10 min，取上清用0.22 μm滤器过滤除菌，-80 ℃保存。

1.5 病毒分离 采用同步接毒的方式，向传代后的F81 细胞悬液按1∶9(体积比)接入经处理后的样品，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，次日用含1%血清的细胞维持液进行换液。每天观察细胞病变(Cytopathic effect,CPE)情况，传至出现较稳定的 CPE 后收毒，同时设正常 F81 细胞为阴性对照。

1.6 PCR鉴定 按照本实验室建立的犬细小病毒 PCR 诊断检测方法[15]对健康犬对照样品、第3代F81细胞培养物进行PCR鉴定，同时设立阳性对照(本实验室保存的CPV分离株)和阴性对照(未接种样品的F81细胞培养物)。通过病毒DNA提取试剂盒提取DNA，以提取后DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(25.0 μL)：2×Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，模板 2.0 μL，上游引物 1.0 μL，下游引物 1.0 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35个循环；72 ℃，10 min。PCR产物4 ℃保存，取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察结果。

1.7 病毒全基因组分析

1.7.1 全基因组扩增 参照参考文献[3,16]扩增病毒的全基因组，方法同1.6，并将本实验室于2012年和2015年分离到的2株病毒(CPV-QD12和CPV-QD15)一同扩增。扩增的DNA产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。阳性PCR产物利用胶回收试剂盒进行胶回收纯化后克隆至pMD18-T载体，连接体系：胶回收产物4 μL，SolutionⅠ5 μL，Vector 1 μL，混匀后16 ℃连接过夜。次日将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，涂板后挑取单菌落，扩大培养后进行菌液PCR鉴定，阳性菌液送青岛睿博生物科技有限公司测序。

1.7.2 全基因组及VP2、NS1序列分析与系统进化树构建 利用DNASTAR进行序列拼接，得到病毒全基因组序列。利用MegAlign软件对本研究获得的序列与参考株序列进行同源性分析。通过与GenBank中近几年发表的其他CPV序列进行比较，进行全基因组及VP2、NS1核苷酸、氨基酸比对分析，并进行基因分型与氨基酸非同义替代分析。利用MEGA 7邻接法构建系统进化树。

2 结果

2.1 病毒分离 样品同步接种F81细胞，盲传到第3代开始出现典型的CPE，表现为接毒细胞脱落、变形、大范围的拉网状病变，阴性对照正常F81细胞生长良好，排列紧密，形状统一(图1)。将本研究于2020年分离到的CPV命名为CPV-QD20株。

图1 光学显微镜下细胞形态(40×)

2.2 PCR鉴定 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，分离毒株的细胞培养物和阳性对照均与预期相符，在481 bp处出现明亮条带；细胞阴性对照培养物PCR扩增结果为阴性(图2)。

图2 PCR扩增鉴定

2.3 病毒全基因组扩增 通过PCR对CPV全基因组进行扩增，结果显示，在712、2 105、1 728、1 591、635、66和100 bp处出现与预期相符的7个条带(图3)。

图3 全基因组的PCR扩增

2.4 序列分析 序列分析发现，分离获得的3株CPV的基因组全长为5 055～5 062 bp。3株CPV全基因核苷酸同源性为99.0%～99.8%。NS1基因核苷酸同源性为99.1%～99.3%，氨基酸同源性为99.0%～99.4%。VP2基因核苷酸同源性为99.3%～99.9%，氨基酸同源性为99.7%～100%。3株CPV与参考毒株全基因核苷酸同源性为90.9%～99.8%。

2.5 系统进化树构建 基于全基因组构建的系统进化树显示，CPV-QD12株与中国分离株MH476593、MF805798、MF805794亲缘关系较近，其中亲缘关系最近的是MH476593，核苷酸同源性为99.7%；CPV-QD15株与2017年中国分离株MH476590亲缘关系最近，核苷酸同源性为99.9%。CPV-QD20株与MG013488、MH476592、MH476584、MH476583、MH476587处在同一分支，与2017年上海分离株CPV-SH1516核苷酸同源性最高，为99.8%(图4)。

图4 基于犬细小病毒全基因组的系统进化树

2.6VP2、NS1蛋白氨基酸非同义替代分析 对3株CPV分离株编码VP2蛋白、NS1蛋白的氨基酸序列与参考序列进行对比,氨基酸非同义替代结果如表1和表2所示。根据CPV基因分型的相关报道[17]，CPV-QD12和CPV-QD15为new CPV-2a型，CPV-QD20为CPV-2c型，健康犬对照样品检出CPV-2c型。

表1 VP2蛋白中非同义替代的氨基酸

续表

表2 NS1蛋白中非同义替代的氨基酸

3 讨论

CPV-2的感染在世界各地非常普遍，本研究进行全基因组测序的3株CPV的基因型分别为new CPV-2a、CPV-2c。CPV-2a、CPV-2b、new CPV-2a、new CPV-2b和CPV-2c在我国均为流行株[9]。近年来，new CPV-2a成为我国部分地区的主要流行型，CPV-2c除了在我国流行之外，还是意大利、德国、乌拉圭、阿根廷、尼日利亚等国家的主要抗原变异型[18]。全基因组系统进化树结果显示，3株CPV与国外CPV分离株亲缘关系较远，与国内参考毒株同源性较高，都处在同一大分支中并没有形成明显独立分支，这说明在青岛地区分离的3株CPV与国内其他CPV流行株均源自同一祖先。但是，本研究全基因组测序的3株CPV的基因型，CPV-QD12和CPV-QD15为new CPV-2a型，CPV-QD20为CPV-2c型，健康犬对照样品也检出CPV-2c型，均与原始的CPV-2存在差异。本研究分离的CPV-QD20为CPV-2c型，说明青岛地区CPV毒株出现了新的基因型，不排除new CPV-2a型和CPV-2c型同时流行的可能。

VP2蛋白是CPV-2的主要结构蛋白，参与宿主免疫应答，VP2基因的突变可能改变CPV-2的类型、感染和致病性[19]。VP2基因的第5、87、267、300、322、323、324、334、341、370、440、555位氨基酸的突变已被证实与CPV-2的感染和致病性有关[3]。2014年以后的大部分CPV-2c分离株中VP2基因的第5位氨基酸都发生A→G突变，此处突变可能改变了CPV的抗原性和免疫原性[20]。本研究中3株CPV分离株都出现了第267位氨基酸F→Y突变，第324位氨基酸 Y→I突变。第267位氨基酸F→Y突变可能在传播和感染中发挥重要作用[12]。第297位氨基酸S→A突变是new CPV-2a和new CPV-2b的标志[9]，本研究的2株new CPV-2a分离株均发生了该突变。第324位氨基酸 Y→I突变是近几年来我国CPV分离株常见的氨基酸突变[21]。第370位氨基酸Q→R突变可能与宿主范围的改变以及宿主红细胞的血凝有关[20]。第426位的突变被用来区分CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c[3]。本研究中new CPV-2a 型CPV-QD12株和CPV-QD15株都在第440位出现氨基酸突变(T→A)，而CPV2c型CPV-QD20株则未出现此突变。

CPV的非结构蛋白NS1和NS2与病毒复制相关[22]。亚洲CPV-2c变异株在NS1基因的第60、544、545、630位氨基酸中都表现出特定的改变，这些氨基酸突变可能有助于进一步阐明CPV的进化情况[23]，对推断CPV变异株的传播是至关重要的[24]。关于CPV非结构基因的研究有限[13]，它们的作用需要进一步评估。

本研究中的3株CPV分离株均是从接种过疫苗的临床发病犬中分离到的。在我国，CPV的商业疫苗株大多数是CPV-2型。接种CPV-2型疫苗可以对免疫动物形成交叉保护，使免疫动物抵抗强毒CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c的攻击[25-27]。有报道显示，近年来new CPV-2a成为我国部分地区的优势变异株[28]，CPV-2型疫苗不能保护免疫犬抵抗new CPV-2a和new CPV-2b的攻击[29]。本研究中的3株CPV分离株分属new CPV-2a和CPV-2c两个基因型，与原始CPV-2毒株存在差异。与其他CPV-2c型相比，本研究分离的CPV-20株在VP2基因和NS1基因中均出现了不同的氨基酸非同义替代。上述发现是否是CPV-2型疫苗免疫失败的原因有待进一步试验验证。

CPV主要经粪口传播，这是幼犬感染的重要原因。本研究从健康犬对照样品中检测到CPV-2c型病毒，说明使用进口CPV弱毒活疫苗的成年犬存在排毒问题。可见，将成年犬与幼犬隔离饲养是保护幼犬的重要措施。本研究认为应该使用CPV流行株研发灭活疫苗，做加强免疫，防止疫病扩散。CPV进化速度快，作为一种易变异的DNA病毒，在时间、空间和宿主方面对CPV进行持续的流行病学监测能够及时掌握CPV变异情况，为疾病防控和疫苗株的更新提供参考。