硝基咪唑类衍生物的合成及其抗菌活性研究

程敬东,王合珍,王 京,罗远纯,张 磊

(1.遵义医科大学 贵州省生物催化与手性药物合成重点实验室，药学院，贵州 遵义 563099;2.遵义市产品质量检验检测院 药品化妆品部，贵州 遵义 563002)

由于抗生素的滥用，目前由细菌感染引发的疾病，特别是耐药细菌，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)、多重耐药结核杆菌(Multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)等，严重威胁着人类的健康[1-2]。

硝基咪唑是一类经典的抗菌药物，具有抗病原微生物、抗肿瘤和抗病毒等多种生物活性[3]，其中甲硝唑、塞克硝唑、奥硝唑等抗菌药物广泛运用于临床。近年来，2种新型硝基咪唑衍生物(德拉马尼和普托马尼)被FDA批准用于治疗耐药结核病[4-5]。这些药物的成功上市表明，硝基咪唑类结构依然具有重要的临床抗菌价值[6-7]。近年来，Varshney等[8]通过不同连接臂，将硝基咪唑和噁唑烷酮两种不同作用机制的结构进行拼合，得到了一系列硝基咪唑衍生物(见图1)，发现化合物a对于多种细菌和耐药菌都具有良好的抗菌活性。Zhang等[9]将我国传统中药黄连的抗菌成分小檗碱与硝基咪唑结构进行拼合，得到了一系列硝基咪唑-小檗碱衍生物。其中，化合物b对于MRSA具有较强的抑制活性。Ullah等[10]将氨基酸引入甲硝唑中，得到了一系列甲硝唑-氨基酸衍生物，其中化合物c对金黄色葡萄球菌的抗菌活性强于甲氧苄啶和环丙沙星。此外，许多研究结果显示，硝基咪唑类药物与其他药效团拼合的策略，可能有利于提高化合物分子的抗菌活性[11]。因此，将硝基咪唑类药物进行结构修饰改造，引入药效基团有利于发现具有更强抗菌活性以及抗耐药菌活性的硝基咪唑衍生物，为后续抗菌药物的研发提供参考。

图1 硝基咪唑类代表性衍生物结构

喹啉是一类以喹啉环为基本母核的杂环化合物，同时也是多种药物分子的药效团，如抗结核药物贝达喹啉、抗疟药物奎宁等。其中，5-氯-8-羟基喹啉是一种喹啉衍生物，对MRSA和结核杆菌均具有较强的抑制活性[12-15]。此外，5-氯-8-羟基喹啉还能够与金属离子形成螯合物，发挥协同抗菌作用[16-17]。因此，我们选择将5-氯-8-羟基喹啉作为抗菌药效团引入硝基咪唑类药物分子中，设计并合成一类结构新颖的硝基咪唑类衍生物，并测试其体外抗菌活性。

本文目标化合物的结构经1H NMR，13C NMR和高分辨质谱分析确证，具体的合成路线如图2所示。以塞克硝唑为起始原料，三苯基膦(PPh3)、偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD)为催化剂，通过Mitsunobu取代反应与5-氯-8-羟基喹啉合成化合物1；以奥硝唑为起始原料，通过取代反应与5-氯-8-羟基喹啉合成化合物2；以甲硝唑为起始原料，三乙胺(TEA)为碱，与对甲苯磺酰氯(TsCl)通过酯化反应合成中间体Z1，再与5-氯-8-羟基喹啉反应合成化合物3；以甲硝唑、塞克硝唑为起始原料，与不同的酰氯合成中间体Z2-Z6，再与5-氯-8-羟基喹啉合成化合物4-8。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 甲硝唑(分析纯，毕得医药)；奥硝唑(分析纯，安耐吉化学)；塞克硝唑(分析纯，安耐吉化学)；三乙胺(分析纯，安耐吉化学)；5-氯-8-羟基喹啉(氯羟喹，分析纯，毕得医药)；偶氮二甲酸二异丙酯(分析纯，安耐吉化学)；三苯基膦(分析纯，安耐吉化学)；对甲基苯磺酰氯(分析纯，安耐吉化学)；氯乙酰氯(分析纯，安耐吉化学)；2-氯丙酰氯(分析纯，安耐吉化学)；4-氯代丁酰氯(分析纯，安耐吉化学)；碘化钾(分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司)；其他试剂均为分析纯，未经处理直接使用。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA ATCC 43300由北纳创联生物科技有限公司提供；金黄色葡萄球菌S.aureusCMCC(B) 26003由遵义市产品质量检验检测院提供。

1.2 仪器 HWCL-1型集热式恒温磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；85-1A型磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；SGW X-4A型显微熔点仪(上海仪电物理光学仪器有限公司)；400MHz DDZ型核磁共振仪(Agilent)；G2-S QTof高分辨质谱仪(Waters)。

1.3 实验方法

1.3.1 5-氯-8-((1-(2-甲基-5-硝基-1H-咪唑-1-基)丙-2-基)氧基)喹啉(化合物1)的合成 向装有磁力搅拌子的10 mL反应管中，依次加入塞克硝唑(100 mg,0.54 mmol)，5-氯-8-羟基喹啉(107 mg,0.59 mmol)，三苯基膦(142 mg,0.54 mmol)，再加入无水THF(3 mL)，在氮气氛围下抽换气3次，置于0 ℃下搅拌10 min。保持0 ℃搅拌，缓慢滴加DIAD(106 μL,0.54 mmol)。滴加完毕后，反应升温至室温搅拌8 h，TLC监测反应完全后，停止反应。减压浓缩溶剂，粗产物由硅胶柱层析纯化，即得目标化合物。

1.3.2 5-氯喹啉-8-氧基-3-(2-甲基-5-硝基-1H-咪唑-1-基)丙醇(化合物2)的合成 向装有磁力搅拌子的25 mL茄形瓶中，依次加入奥硝唑(100 mg,0.46 mmol)，5-氯-8-羟基喹啉(82 mg,0.46 mmol)，K2CO3(189 mg,1.37 mmol)，催化量KI，DMF(3 mL)，置于油浴锅中搅拌均匀，升温至80 ℃反应6 h，TLC监测反应完全后，停止加热。加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取，合并有机层，用水、饱和食盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥有机层，抽滤，减压浓缩溶剂，粗产物经硅胶柱层析纯化，即得目标化合物。

1.3.3 中间体Z1-Z6合成通式 向装有磁力搅拌子的25 mL反应瓶中，依次加入甲硝唑/塞克硝唑(2.92 mmol)，无水二氯甲烷(5 mL)，三乙胺(1.2 mL,5.84 mmol)，在0 ℃下快速用氮气抽换气三次，然后置于0 ℃冰水浴中搅拌，将不同取代基的酰氯(8.76 mmol)溶解在3 mL无水二氯甲烷中，缓慢滴加至反应体系，约15 min滴毕，自然升温至室温反应4 h，TLC监测反应完全后，停止反应。加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取，合并有机层，用水、饱和食盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥有机层，抽滤，减压浓缩溶剂，粗产物经硅胶柱层析纯化，即得中间体Z1-Z6，收率64%～90 %。

1.3.4 5-氯-8-(2-(2-甲基-5-硝基-1H-咪唑-1-基)乙氧基)喹啉(化合物3)的合成 向装有磁力搅拌子的25 mL反应瓶中，依次加入中间体Z1(100 mg,0.31 mmol)，5-氯-8-羟基喹啉(55 mg,0.31 mmol)，K2CO3(127 mg,0.91 mmol)和DMF(3 mL)，置于油浴锅中搅拌均匀，升温至80 ℃反应6 h，TLC监测反应完全后，停止加热。加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用水、饱和食盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥有机层，抽滤，减压浓缩溶剂，粗产物经硅胶柱层析纯化，即得目标产物。

1.3.5 目标化合物4-8的合成通式 向装有磁力搅拌子的25 mL反应瓶中，依次加入中间体Z2-Z6(0.31 mmol)，5-氯-8-羟基喹啉(0.31 mmol)，K2CO3(0.91 mmol)和DMF(3 mL)，置于油浴锅中搅拌均匀，升温至80 ℃反应6 h，TLC监测反应完全后，停止加热。加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用水、饱和食盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥有机层，抽滤，减压浓缩溶剂，粗产物经硅胶柱层析纯化，即得目标产物(见图2)。

图2 目标化合物的合成路线

1.4 抑菌活性测试

1.4.1 药敏纸片法测定抑菌活性 以药敏纸片法评价所有母体化合物和目标化合物对2株金黄色葡萄球菌(MRSA ATCC 43300、S.aureusCMCC(B) 26003)的体外抑菌活性。首先，称取一定量的样品用DMSO溶解配置成5 mg/mL药液备用。用接种环蘸取少许供试细菌菌落，用平板划线法接种于LB 固体培养基上，置于37 ℃培养箱中培养过夜。然后，挑起少量单一菌落接入LB液体培养基中，于37 ℃培养箱中培养8 h，根据麦氏比浊管测定，配制成0.5个麦氏单位的供试菌菌液。再取0.2 mL菌液接种于倒好平板的LB培养皿中，用涂布棒涂布均匀，待菌悬液充分吸附后，将制好的平板分为5部分，粘贴滤纸片。采用DMSO作为空白对照组，取10 μL配置好的样品母液，加入滤纸片进行吸收，于37 ℃培养箱中培养18 h。用交叉法测量抑菌圈的直径，计算平均值。

1.4.2 化合物MIC值的测定 采用微量液体稀释法，测试目标化合物和母体化合物的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。首先，将待测化合物溶解于一定体积的DMSO中，配制成质量浓度为5 mg/mL的溶液，再用DMSO进行连续等梯度稀释，最终得到质量浓度为5～0.125 mg/mL的待测溶液备用。将处在对数生长期的细菌以1∶1 000的稀释比例接种于LB培养基中，制成待测菌液混悬液备用。然后，向96孔细胞培养板每排第1～12孔中加入100 μL待测菌液，再将每排第1～12孔按高浓度到低浓度的顺序依次加入10 μL相应化合物溶液，以每孔加入10 μL的DMSO作为空白对照，以不加入溶剂作为细菌的生长对照孔，设置3组平行实验，置于37 ℃培养箱中培养18 h后观察抑菌结果，得到完全抑制细菌生长的MIC值。

2 结果

2.1 目标化合物的波谱解析 化合物1：白色固体30 mg，收率为23 %。m.p.148～149 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.84(dd,J=4.2,1.7 Hz,1H),8.49(dd,J=8.5,1.7 Hz,1H),7.94(s,1H),7.51(dd,J=8.6,4.2 Hz,1H),7.45(d,J=8.4 Hz,1H),6.92(d,J=8.4 Hz,1H),5.08 - 4.96(m,1H),4.80(dd,J=14.4,2.3 Hz,1H),4.53(dd,J=14.4,9.2 Hz,1H),2.78(s,3H),1.56(d,J=6.3 Hz,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ152.75,152.24,149.73,141.38,133.40,133.22,127.47,126.28,123.85,122.49,112.23,75.66,51.64,17.37,15.05.HRMS-ESI(m/z):calcd for C16H15ClN4O3[M+H]+347.0911,found 347.0905。

化合物2：淡黄色固体62 mg，收率38 %。m.p.106～109 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.81(dd,J=4.3,1.6 Hz,1H),8.58(dd,J=8.6,1.6 Hz,1H),7.92(s,1H),7.57(dd,J=8.5,4.4 Hz,2H),7.11(d,J=8.3 Hz,1H),4.70(d,J=11.0 Hz,1H),4.46-4.39(m,2H),4.33(dd,J=9.8,2.2 Hz,1H),4.21(dd,J=9.9,5.9 Hz,1H),2.59(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ153.20,152.36,149.41,140.72,134.22,133.50,127.49,126.97,124.44,122.73,113.26,73.22,69.87,49.15,14.90.HRMS-ESI(m/z):calcd for C16H15ClN4O4[M+H]+363.0860,found 363.0854。

化合物3：淡黄色固体43 mg，收率42%。m.p.185～187 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.91(dd,J=4.2,1.7 Hz,1H),8.51(dd,J=8.6,1.7 Hz,1H),7.97(s,1H),7.56-7.47(m,2H),6.91(d,J=8.4 Hz,1H),4.90-4.86(m,2H),4.57(t,J=4.9 Hz,2H),2.86(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ153.21,152.90,149.94,140.72,133.62,133.05,127.23,126.27,123.52,122.65,109.15,68.09,46.18,14.94.HRMS-ESI(m/z):calcd for C15H13ClN4O3Na [M+Na]+355.0574,found 355.0568。

化合物4：黄色固体47 mg，收率59 %。m.p.113～116 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.99(dd,J=4.2,1.7 Hz,1H),8.58(dd,J=8.6,1.7 Hz,1H),7.86(s,1H),7.60(dd,J=8.6,4.2 Hz,1H),7.48(d,J=8.4 Hz,1H),6.81(d,J=8.4 Hz,1H),4.93(s,2H),4.57(hept,J=4.2,3.5 Hz,4H),2.35(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ168.31,152.39,151.11,150.04,140.46,133.24,127.38,126.09,124.12,122.76,109.58,66.17,63.67,44.82,14.33.HRMS-ESI(m/z):calcd for C17H15ClN4O5Na [M+Na]+413.0629,found 413.0623。

化合物5：黄色固体89 mg，收率57 %。m.p.58～60 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.95(d,J=4.2 Hz,1H),8.55(d,J=9.1 Hz,1H),7.78(s,1H),7.56(dd,J=8.6,4.2 Hz,1H),7.43(d,J=8.4 Hz,1H),6.79(d,J=8.4 Hz,1H),5.03(q,J=6.8 Hz,1H),4.51(d,J=6.1 Hz,2H),4.46(d,J=9.0 Hz,2H),2.26(s,3H),1.74(d,J=6.8 Hz,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ171.68,152.27,151.16,149.95,140.79,133.32,133.15,127.52,126.19,124.18,122.65,111.24,63.67,44.83,18.63,14.29.HRMS-ESI(m/z):calcd for C18H17ClN4O5Na [M+Na]+427.0785,found 427.0779。

化合物6：黄色油状物67 mg，收率38 %。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.96(d,J=4.2 Hz,1H),8.53(d,J=8.5 Hz,1H),7.91(s,1H),7.58-7.48(m,2H),6.97(d,J=8.4 Hz,1H),4.56(t,J=5.3 Hz,2H),4.45-4.39(m,2H),4.28-4.21(m,2H),2.60(t,J=7.7 Hz,2H),2.45(s,3H),2.26(dt,J=12.9,6.7 Hz,2H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ172.61,153.77,150.96,149.86,140.91,133.27,133.14,127.23,126.53,122.50,108.90,67.77,62.75,45.16,30.54,24.04,14.46.HRMS-ESI(m/z):calcd for C19H19ClN4O5[M+H]+419.1122,found 419.1116。

化合物7：黄色固体67 mg，收率38 %。m.p.104～107 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.95(dd,J=4.2,1.7 Hz,1H),8.55(dd,J=8.5,1.6 Hz,1H),7.83(s,1H),7.57(dd,J=8.6,4.2 Hz,1H),7.45(d,J=8.4 Hz,1H),6.70(d,J=8.4 Hz,1H),5.39-5.28(m,1H),4.84(s,2H),4.59(dd,J=14.7,2.9 Hz,1H),4.17(dd,J=14.6,9.5 Hz,1H),2.32(s,3H),1.39(d,J=6.3 Hz,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ167.99,152.56,151.00,150.01,140.58,133.29,133.13,127.46,126.18,124.18,122.75,109.72,71.26,66.53,49.90,17.70,14.47.HRMS-ESI(m/z):calcd for C18H17ClN4O5Na [M+Na]+427.0785,found 427.0779。

化合物8：白色固体45 mg，收率30 %。m.p.128～131 ℃,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.95(dd,J=4.2,1.6 Hz,1H),8.58(dd,J=8.5,1.6 Hz,1H),7.63(s,1H),7.58(dd,J=8.6,4.2 Hz,1H),7.37(d,J=8.4 Hz,1H),6.67(d,J=8.4 Hz,1H),5.29-5.23(m,1H),4.84(q,J=6.8 Hz,1H),4.52(dd,J=14.6,2.8 Hz,1H),4.08(dd,J=14.6,10.0 Hz,1H),2.04(s,3H),1.73(d,J=6.8 Hz,3H),1.43(d,J=6.3 Hz,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ171.73,152.41,150.94,149.78,140.66,133.31,132.95,127.61,126.15,124.18,122.62,110.58,74.81,71.18,49.84,18.78,17.71,14.25.HRMS-ESI(m/z):calcd for C19H19ClN4O5Na [M+Na]+441.0942,found 441.0936。

2.2 目标化合物的抗菌活性 由表1可知，所有目标化合物对S.aureus均显示出较强的抗菌活性，且活性强于硝基咪唑母体化合物；部分化合物对MRSA显示出较弱的抑制活性。同时，实验结果还表明，3种硝基咪唑母体化合物对金黄色葡萄球菌具有较弱的抗菌活性，但均未显示出抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的活性，而母体化合物5-氯-8-羟基喹啉对2种金黄色葡萄球菌都具有较强的抑制活性。

表1 目标化合物的抗菌活性

2.3 目标化合物的MIC值 为进一步研究目标产物的抗菌活性，采用经典的微量液体稀释法，测试目标化合物对2种金黄色葡萄球菌的MIC值。由表2可知，目标产物对金黄色葡萄球菌均具有较强的抗菌活性，MIC值为0.59～2.75 μmol，实验结果与药敏纸片法一致。其中，化合物5的MIC为0.59 μmol，对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最高，是母体药物甲硝唑的29倍。

表2 目标化合物的MIC值

根据其MIC值结果进行化合物构效关系的分析，结果显示，目标产物中连接臂的长度会对抗菌活性产生影响，连接臂越长抗菌活性越弱，而连接臂中引入甲基会增强其抗菌活性。此外，目标产物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱，仅化合物6显示出较弱的活性，其MIC值为2.39 μmol。与药敏纸片法实验结果类似，硝基咪唑母体化合物仅对金黄色葡萄球菌有较弱的抑制作用，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌无效；而母体化合物5-氯-8-羟基喹啉对两种金黄色葡萄球菌都具有较强的抑制活性。

上述研究也表明，将5-氯-8-羟基喹啉作为抗菌药效团引入硝基咪唑类药物分子，能够显著提高硝基咪唑类药物的抗金黄色葡萄球菌活性，但是目标产物的活性均弱于母体5-氯-8-羟基喹啉，这可能与测试的菌种类型较少有关，或与有氧培养条件未能发挥硝基咪唑药效作用有关。

3 讨论

本文以硝基咪唑类药物甲硝唑、奥硝唑、塞克硝唑为原料，将5-氯-8-羟基喹啉作为抗菌药效团引入硝基咪唑类药物分子，设计合成了一系列新型硝基咪唑类衍生物。采用药敏纸片法和微量液体稀释法，分别测试目标产物对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性。实验结果表明，目标产物对金黄色葡萄球菌的抗菌作用较强，而对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的作用较弱。本文的研究为硝基咪唑类衍生物的抗菌活性研究提供了一定的实验基础。