肝脏生物钟紊乱对CG-IUGR大鼠糖尿病高易感的可能作用

袁冰舒，杜运松，李丽娟

(1.遵义医科大学 病理生理学教研室，贵州 遵义 563099; 2.界首市人民医院 病理科，安徽 界首 236500)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是常见代谢紊乱性疾病，其发病与遗传和环境等因素相互作用有关。DM的发病率呈逐年上升的趋势[1]。现有研究认为，DM的发病可追溯至胚胎发育时期。流行病学及相关研究表明，胎儿期生长发育不良即宫内发育迟缓(Intrauterine growth retardation,IUGR)个体，特别是表现出生长追赶的IUGR(Catch-up growth intrauterine growth retardation,CG-IUGR)个体，在成年后对DM等代谢性疾病的易感性明显增加，但其具体机制尚不明确[2-4]。DM的临床表现主要为血糖升高。糖原合成和分解等是维持血糖稳定的重要机制[5]。糖原合成的关键酶是糖原合成酶(Glycogen synthetase,GS)，GS通过促进肝细胞及骨骼肌细胞等合成糖原以维持血糖水平[6]。大量研究已经证实GS的表达及活性降低参与DM发病，但其间的机制亦不明确。

生物钟是指生物体的生命活动具有一定时钟节律性，包括药物代谢、机体生理功能等都表现出生物钟节律。生物钟节律的形成与生物钟基因的振荡表达有关，近年有研究证实生物钟及相关钟基因表达改变是DM发病的关键机制[7-9]。Marcheva等研究发现小鼠葡萄糖耐量和胰岛素(Insulin,INS)敏感性降低可能与胰腺生物钟基因BMAL1或CLOCK的功能缺失有关；Dyar等把小鼠骨骼肌的BMAL1特异性敲除后，发现其骨骼肌葡萄糖转运体4(Glucose transporter 4,GLUT-4)的表达降低，同时胰岛素刺激的葡萄糖摄取能力减弱；Liu等发现CLOCK功能缺失小鼠的骨骼肌INS敏感性降低；进一步研究发现小鼠成肌细胞的CLOCK 或 BMAL1功能缺失后会出现胰岛素抵抗 (Insulin resistance,IR) 效应[10-12]。但生物钟紊乱是否与CG-IUGR个体DM高易感有关并不清楚。

因此，本研究通过低热量饮食法建立CG-IUGR大鼠模型，通过检测肝脏生物钟基因BMAL1、CLOCK表达及糖代谢功能的变化，分析生物钟改变在CG-IUGR大鼠糖代谢异常和DM高易感中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 体重为180～200 g的8周龄Sprague-Dawley (SD)大鼠(实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0011，北京维通利华实验技术有限公司)。

1.2 主要试剂 葡萄糖注射液 (重庆迪康长江制药有限公司)；INS注射液 (江苏万邦生化医药股份有限公司) ；血糖试纸 (强生中国医疗器材有限公司)；戊巴比妥钠 (北京化学试剂公司)；碘[125]胰岛素放射免疫试剂盒 (北方生物技术研究所有限公司)；GS酶活性试剂盒 (Solarbio公司)；BCA试剂盒 (Solarbio公司)；鼠抗Beta-actin单克隆抗体(美国NOVUS公司)；兔抗BMAL1、CLOCK多克隆抗体(美国Abcam公司)。

1.3 模型复制及分组 实验分为Control组(正常对照组)和CG-IUGR组。母鼠孕期采用常规饲养(30 g/d，1 031.9 KJ/d)，所产子代大鼠常规喂养至8周龄后作为Control组大鼠；母鼠孕期采用低热量饮食饲养(12 g/d，412.8 KJ/d)，产下子代大鼠后，选取出生体重低于Control组新生子代大鼠平均体重2个标准差的IUGR大鼠进行常规饲养，至8周龄后把具有生长追赶的IUGR大鼠选入CG-IUGR组。

1.4 检测指标

1.4.1 两组大鼠生长发育情况及肾周脂肪重量 在大鼠0～8周期间每周测量其身长和体重，并计算体重指数 (Body mass index,BMI)，BMI=kg/m2。在大鼠喂养至8周龄时，经腹腔注射2 %戊巴比妥钠液 (0.2 mL/100 g)，麻醉后分离并称量大鼠双侧肾周脂肪的重量。

1.4.2 两组8周龄大鼠葡萄糖代谢相关指标 取两组8周龄大鼠，于ZT3检测其葡萄糖代谢相关指标。

1.4.2.1 空腹血糖 (Fasting blood glucose,FBG) 和空腹胰岛素 (Fasting insulin,FINS)水平 大鼠空腹12 h后，通过断尾法取尾静脉血，用强生血糖仪检测两组大鼠的FBG水平；分离颈动脉取血并提取血清，按照试剂盒说明书检测血清FINS水平。

1.4.2.2 葡萄糖耐量试验 (Glucose tolerance test,GTT) 和胰岛素耐量试验 (Insulin tolerance test,ITT) GTT：大鼠空腹12 h后，经腹腔缓慢注射葡萄糖注射液 (2 g/kg) ，并在注射后的0、15、30、60、90、120 min采集尾静脉血，用强生血糖仪检测血糖水平。ITT：大鼠空腹12 h后，经腹腔缓慢注射INS注射液 (0.1 U/kg)，血糖检测方法同GTT。

1.4.2.3 葡萄糖负荷后15 min胰岛素水平 腹腔注射2 %戊巴比妥钠 (0.2 mL/100 g)麻醉大鼠后，经腹腔注射20 %葡萄糖注射液 (2 g/kg)，15 min后，分离颈动脉血的血清，按照试剂盒说明书检测其INS水平。

1.4.2.4 肝脏GS酶活性 腹腔注射2% 戊巴比妥钠 (0.2 mL/100 g)麻醉大鼠后，取其肝脏组织并置于-80 ℃冰箱保存备用。用RIPA裂解液提取大鼠肝脏总蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，按照GS酶活性试剂盒说明书测定GS活性。

1.4.3 两组8周龄大鼠BMAL1和CLOCK 的蛋白表达水平 取大鼠肝脏组织，采用Westen blot方法检测肝脏BMAL1和CLOCK 的蛋白表达水平。具体为：用RIPA裂解液提取大鼠肝脏总蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，经电泳、转膜、封闭后，加入一抗 (兔抗BMAL1、CLOCK多抗，稀释比为1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，第2天吸出一抗后加入二抗 (鼠抗β-actin单抗，稀释比为1∶5 000)，室温孵育2 h，TBST洗涤3次，ECL显影拍照。

1.4.4 8周龄CG-IUGR大鼠肝脏生物钟改变与葡萄糖代谢的相关性分析 分析肝脏BMAL1、CLOCK的蛋白表达水平与葡萄糖负荷后15 min的血糖、血清INS水平及GS酶活性间的相关性。

1.5 统计学分析 所有实验数据运用软件SPSS 19.0进行分析，重复测量方差分析用于体重等重复测量数据，t检验用于两组间比较，Pearson’s法分析相关性，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生长发育情况及肾周脂肪重量 CG-IUGR大鼠出生时的体重、身长明显低于Control组大鼠(P<0.05)，随着周龄的增加，CG-IUGR大鼠身长、体重及BMI均明显增加。8周龄CG-IUGR大鼠的肾周脂肪重量亦明显增加(P<0.05)。结果表明在生长发育过程中，CG-IUGR大鼠出现明显的生长追赶现象及肥胖倾向(见图1)。

A：两组大鼠0～8周龄的身长变化；B：两组大鼠0～8周龄的体重变化；C：两组大鼠0～8周龄的体重指数变化；D：两组大鼠8周龄的肾周脂肪重量；*：与Control组比较，P<0.05; n=8。

2.2 两组8周龄大鼠葡萄糖代谢变化

2.2.1 大鼠FBG和FINS水平 两组大鼠FBG无明显差异 (P>0.05)，但CG-IUGR大鼠血清FINS水平低于Control组 (P<0.05)。结果提示IUGR可影响成年CG-IUGR大鼠的FINS水平(见图2)。

*：与Control组比较，P<0.05，n=6。

2.2.2 大鼠葡萄糖耐量及INS耐量情况 GTT结果显示，两组8周龄大鼠在葡萄糖负荷后的各个时间点血糖均升高，且均在15 min时达最大值。与Control组相比较，CG-IUGR组大鼠糖负荷后各时间点的血糖升高更明显(P<0.05) 。ITT结果显示，CG-IUGR组大鼠在注射INS后各时间点的血糖水平亦均明显高于Control组 (P<0.05) 。这些结果提示成年CG-IUGR大鼠对葡萄糖和胰岛素的耐受均下降(见图3)。

A：两组8周龄大鼠GTT实验结果；B：两组8周龄大鼠ITT实验结果；*：与Control组比较，P<0.05,n=6。

2.2.3 大鼠葡萄糖负荷15 min后的血清INS水平 葡萄糖负荷15 min后，CG-IUGR组大鼠血清INS水平明显高于Control组 (P<0.05) 。结果提示成年CG-IUGR大鼠存在INS分泌紊乱和潜在IR效应(见图4)。

*：与Control组比较，P<0.05,n=6。

2.2.4 大鼠GS酶活性 CG-IUGR组大鼠肝脏的GS酶活性明显降低，与Control相比较，P<0.05。结果提示IUGR可降低CG-IUGR大鼠肝脏GS的酶活性(见图5)。

*：与Control组相比较，P<0.05，n=6。

2.3 两组8周龄大鼠肝脏BMAL1和CLOCK的蛋白表达水平 CG-IUGR大鼠肝脏BMAL1、CLOCK 的蛋白表达水平显著降低，与Control相比较，P<0.05。结果提示IUGR可下调肝脏BMAL1、CLOCK的蛋白表达，改变成年CG-IUGR大鼠肝脏生物钟节律(见图6)。

*：与Control组比较，P<0.05，n=6。

2.4 CG-IUGR大鼠肝脏BMAL1和CLOCK蛋白表达与其糖代谢变化之间的相关性 CG-IUGR大鼠肝脏BMAL1和CLOCK 蛋白表达水平与葡萄糖负荷15 min的血糖及血清INS水平均呈现负相关性 (P<0.05)；与肝脏GS的酶活性呈现正相关性 (P<0.05)。提示，CG-IUGR大鼠葡萄糖负荷15 min的血糖和血清INS水平升高可能与肝脏BMAL1和CLOCK 的蛋白表达减少有关，其肝脏GS酶活性的降低亦可能与肝脏BMAL1和CLOCK的蛋白表达下降有关(见图7)。

A：肝脏BMAL1和CLOCK的蛋白表达水平与葡萄糖负荷15 min的血糖水平之间的Pearson's相关性分析；B：肝脏BMAL1和CLOCK的蛋白表达水平与葡萄糖负荷15 min的血清INS水平之间的Pearson's相关性分析；C：肝脏BMAL1和CLOCK的蛋白表达水平与GS的酶活性之间的Pearson’s相关性分析，n=6。

3 讨论

本研究结果显示，与Control组比较，CG-IUGR大鼠出生时的体重及身长均明显降低，但其体重、身长及BMI在生长发育过程中明显增加；8周龄时肾周脂肪的重量亦明显增加。郑锐丹等通过孕期30%正常饮食法复制IUGR大鼠，发现IUGR大鼠出生时体重、身长显著低于对照组，之后出现生长追赶，12周龄的体重及BMI均显著高于对照组；曹秋丽等采用33%正常饮食法复制IUGR大鼠，发现刚出生的IUGR大鼠体重显著低于对照组，随后出现生长追赶并在7周龄时体重显著高于对照组；另有学者发现低蛋白饮食法复制IUGR大鼠模型亦有相同的结果[13-15]。可见，不同方法复制的IUGR大鼠在出生后往往表现出生长追赶和肥胖倾向。根据上述文献资料及本研究结果推测，低热量饮食法可造成IUGR大鼠发生生长追赶并呈现肥胖趋势，与文献报道一致。

根据GTT和ITT的实验结果及糖负荷后15 min的血清INS水平变化，本研究发现CG-IUGR大鼠糖代谢功能降低，表现为对葡萄糖和INS的耐受降低，具有潜在的IR效应。有学者在2012年调查了荷兰饥荒事件，结果表明，与正常胎儿相比较，宫内发育迟缓的胎儿在成年后表现出葡萄糖耐受不良现象，并且其罹患DM的风险明显增加[16]。Chen等[17]采用50%正常饮食法复制IUGR大鼠模型，发现其成年后FBG和FINS明显升高，并且存在IR效应；Xing等[18]采用低蛋白饮食法复制IUGR大鼠模型，发现IUGR大鼠早期即出现生长追赶现象，且在成年后出现IR以及INS敏感性降低的现象。本课题组前期研究亦表明，CG-IUGR个体成年后DM易感性增加[2]。根据以上资料和本研究结果推测，IUGR可使CG-IUGR大鼠糖代谢能力降低，这可能是CG-IUGR大鼠DM发生的重要基础。

本研究还发现CG-IUGR大鼠肝脏GS的酶活性显著下降。GS是糖原合成的限速酶，在葡萄糖代谢和维持血糖稳态中发挥重要作用。大量研究显示，GS酶活性降低与2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发生有重要关联。Jensen 等研究发现，T2DM患者骨骼肌 GS 的蛋白含量显着降低，且其酶活性呈下降状态；Cui等研究发现，T2DM大鼠肝脏GS酶活性显著降低；Zhang等研究发现，T2DM小鼠肝糖原含量显著下调，肝脏GS蛋白表达亦同步下调[19-21]。根据以上资料和本研究结果推测，GS的酶活性降低可能是CG-IUGR大鼠葡萄糖代谢异常和DM易感性增加的重要机制，但GS酶活性下降与CG-IUGR个体发病的关系及其发生的机制并不清楚。

进一步分析发现CG-IUGR大鼠肝脏BMAL1和 CLOCK的蛋白表达均降低，同时发现肝脏BMAL1、CLOCK的蛋白表达与葡萄糖负荷后15 min的血糖和血清INS水平均呈负相关性，而与GS的酶活性呈正相关性。机体很多生理活动均受生物钟调控。生物钟是机体生命活动的内在节律性，生物钟基因的振荡表达是生物钟形成的主要依据。BMAL1、CLOCK是生物钟的核心钟基因。目前大量文献资料显示，生物钟紊乱与代谢性疾病包括DM等的发病明显相关。Zhou等[22]研究发现，肝细胞BMAL1或CLOCK的功能缺失后，小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性均降低。Harfmann等[23]特异性敲除小鼠骨骼肌 BMAL1 后发现，其24 h平均血糖及FINS水平升高，存在葡萄糖耐受不良，同时骨骼肌GLUT4的 mRNA 和蛋白质水平显着降低。Rakshit等[24]通过高脂喂养过表达β细胞BMAL1的小鼠后发现，过表达BMAL1对高脂引起的葡萄糖耐受不良现象具有保护作用。Doi等[25]发现肝脏GS的节律性表达依赖于CLOCK的调节，肝脏CLOCK功能缺失后会抑制GS的表达，同时造成肝糖原合成减少，促进IR的发生。杨路达等[26]研究发现全身性和肝脏敲除 BMAL1 基因的小鼠均存在葡萄糖耐受不良及INS敏感性降低现象，同时肝糖原含量显著减少，且其肝脏及原代肝细胞的GS表达水平亦显著降低。根据上述资料及本研究结果推测，CG-IUGR大鼠对DM的易感性增加可能与IUGR下调肝脏生物钟基因BMAL1、CLOCK的表达有关，但二者的关系及其具体发生机制尚需进一步研究证实。

另外，本研究中CG-IUGR大鼠的FBG水平无显著变化，血清FINS水平下降，这些结果似乎与T2DM个体FINS水平升高相矛盾。但是，Brown等研究发现，高温诱导的IUGR胎羊血浆INS水平以及胰岛INS含量均显著降低，另有学者发现IUGR大鼠的胰岛发育受损且β细胞数量减少[27-28]。根据以上资料和本研究结果推测，CG-IUGR大鼠血清FINS水平轻度下降可能与宫内营养不足导致胰岛发育受损及其造成INS的分泌下降有关，还可能与实验条件及模型复制方法等不同进而导致IR效应的进展程度不同有关。

以上结果表明，CG-IUGR大鼠糖代谢功能降低，对DM的易感性增加，并且CG-IUGR大鼠对DM的易感性增加可能与IUGR下调肝脏生物钟基因BMAL1、CLOCK的表达有关，但其中的具体机制还需进一步研究证实。