益生菌脐橙全果汁工艺优化及香气成分分析

黄 帆，林 军，袁洪燕，周丽玲，罗佳倩，李高阳，5*

（1 湖南省农业科学院农产品加工研究所 长沙 410125 2 湖南大学研究生院隆平分院 长沙 410125 3 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室 长沙 410125 4 湖南省果蔬加工与质量安全国际科技创新合作基地 长沙 410125 5 湖南省洞庭实验室 长沙 410125）

近年来，随着人们对食品营养与健康的关注，含有益生菌的果蔬汁逐渐赢得大众青睐。 利用果蔬汁制作益生菌产品，不仅可以提供菌体生长繁殖需要的基本物质，还适用于乳糖不耐症或乳糖酶缺乏人群食用[1-2]。 发酵果蔬汁饮品富含大量的有益代谢产物，促使有益活性因子被人体肠道充分吸收，增强人体内的益生菌效应，维持肠道微生物群的生态平衡[3-4]。此外，乳酸菌在果蔬汁中繁殖至106CFU/mL 以上，就能达到延长饮品货架期的作用[5]。

脐橙是我国的大众水果，富含大量对人体有益的成分，色泽诱人，酸甜适口，是最受欢迎的水果之一[6]。 目前脐橙加工以制汁为主，产生大量的果渣副产物，占脐橙鲜果总质量50%左右[7]。 果渣中含有大量功能性成分，如果胶、膳食纤维、类黄酮、多酚等，对人体具有疏肝理气、止咳润肺和预防心血管疾病等作用[8-9]。 开发脐橙全果产品不仅可以实现资源的全利用，而且可以保留果渣中的功能活性成分，从而提高橙汁营养价值，实现“变废为宝”。

目前国内外学者对益生菌发酵脐橙汁的研究主要为压榨取汁后进行轻度发酵，而对脐橙全果制汁研究较少，果渣部分的营养素及活性组分未得到利用[10-11]。在开发功能性益生菌脐橙全果饮品时，其工艺条件不仅对益生菌的生长和生理功效起关键作用，还会影响产品的营养价值和典型风味。 本研究以脐橙全果汁为原料，复合乳酸菌发酵，以活菌数和风味为指标优化，分析最佳工艺条件下的风味物质变化规律，以期开发一款具有益生活性的脐橙全果汁饮品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

崀山脐橙，购于邵阳市新宁县，无损伤和腐烂。

菌种：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），实验室分离保存。

MRS 培养基，广东环凯生物科技有限公司。

1.2 设备与仪器

九阳高速破壁调理机JYL-Y99，九阳股份有限公司；立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗机械厂；高压均质机SRH，上海申鹿均质机有限公司；SPX-150 培养箱，中仪国科科技有限公司；50/30 μm 固相萃取仪，德国CNW 公司；GC-MS 联用仪（7890A-5975C 型），美国Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 脐橙全果汁制备工艺流程[12]脐橙→洗净→打浆→配比→过滤→高压均质→调配→巴氏杀菌→冷却→发酵→益生菌脐橙全果汁。

操作要点[13-14]：脐橙经自来水清洗、沥水后打浆，剥皮后打汁；经预试验得到脐橙全果汁的质量比为全果浆∶果汁∶水=2∶8∶5。 用120 目尼龙纱布过滤得到脐橙全果汁，高压均质25～30 MPa，6 min，用NaHCO3调节pH=4.5，加果葡糖浆8%进行调配，于80 ℃巴氏杀菌10 min。

1.3.2 脐橙全果汁的发酵[15]将实验室保存的植物乳杆菌和干酪乳杆菌分别置于MRS 肉汤中，36℃培养48 h，按照一定菌种比例，将活菌数约1×107CFU/mL 的菌液接种于100 mL 脐橙全果汁中。

1.3.3 脐橙全果汁的活菌计数和感官评分 活菌数参照GB 4789.35-2016《乳酸菌检验》计数。 建立感官评定小组（10 人），从饮品的颜色、组织、风味和口感进行评分[16]。 评分细则见表1。

表1 全果汁感官评分标准Table 1 Sensory scoring criteria of whole juice

1.3.4 单因素优化实验

1.3.4.1 菌种比例的确定 根据工艺流程调配每份100 mL 脐橙全果汁，对菌种比例进行单因素优化。 将植物乳杆菌和干酪乳杆菌的比例设定为0∶1，1∶2，1∶1，2∶1，1∶0，接种量3%，35 ℃下静置24 h，对脐橙全果汁进行活菌计数和感官评分。

1.3.4.2 发酵温度的确定 根据工艺流程调配每份100 mL 脐橙全果汁，对温度进行单因素优化。按照菌种比例1∶1，接种量3%，将温度设定为29，32，35，38，41 ℃，静置发酵24 h，对脐橙全果汁进行活菌计数和感官评分。

1.3.4.3 发酵时间的确定 根据工艺流程调配每份100 mL 脐橙全果汁，对时间进行单因素优化。按照菌种比例1∶1，接种量3%，温度35 ℃，将静置时间设定为6，12，24，36，48 h，对脐橙全果汁进行活菌计数和感官评分。

1.3.4.4 接种量的确定 根据工艺流程调配每份100 mL 脐橙全果汁，对接种量进行单因素优化。按照菌种比例1∶1，将接种量设定为1%，2%，3%，4%，5%，35 ℃下静置24 h，对脐橙全果汁进行活菌计数和感官评分。

1.3.5 Box-Behnken 优化设计试验 基于单因素实验，通过响应面法获得最优发酵温度、时间和接种量，以活菌数（Y1）和感官评分（Y2）为模型响应值[17-18]。 赋予权重各50%[19-20]。 试验设计见表2。

表2 响应面发酵工艺水平Table 2 Response surface fermentation technology level

1.3.6 GC-MS 取10 mL 样品于进样瓶中，加入20 μL 环己酮（0.1894 mg/mL）和4 g 氯化钠，在50℃水浴中平衡15 min，顶空吸附40 min，插入GC解吸5 min[21-22]。

色谱条件[23-24]： 色谱柱DB-5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃，升温程序为初始温度40 ℃，以4 ℃/min 升至200 ℃（2 min），最终以10 ℃/min 升至250 ℃（10 min）； He 流速1.0 mL/min；不分流进样。

质谱条件：EI 电离源，离子源温度230 ℃；电子能量70 eV，接口温度250 ℃，扫描范围35～500 amu。

1.3.7 香气成分分析[25]定性分析： 将数据与NIST 2011 质谱库比对分析。

定量分析：采用内标法，按照如下公式计算：

1.4 数据处理方法

试验重复3 次，用SPASS 22.0 软件进行方差

2.1.3 发酵时间的影响 随着发酵时间的延长，逐步抵达发酵终点，活菌数明显增大，随后趋于平显著性分析，OriginPro 2021b 软件作图，Design-Expert 8.0.6 软件分析Box-Behnken。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 菌种比例的影响 如图1 所示，混合菌株能更好地适应脐橙全果汁，比单一菌株发酵活菌数高，且混合菌株发酵饮品的喜爱度高。饮品中以1∶2 添加植物乳杆菌和干酪乳杆菌时，发酵后的活菌数增至最高值，然而，过多的乳酸菌会加快产品的发酵进程，导致脐橙全果汁pH 值急速下降，酸甜比例失衡；当配比为1∶1 时，酸甜适中，风味浓郁，此条件下的饮品获得最高评分（85.05 分）。全果汁中添加的菌种比例最优为1∶1。

图1 菌种比例与活菌数和感官评分的关系Fig.1 Relationship between bacteria proportion and viable count and sensory score

2.1.2 发酵温度的影响 温度升高，乳酸菌活力充分发挥作用，达到最大活菌数而后下降，然而，过高的温度会导致脐橙全果汁发酵味浓郁，遮盖了本身的果香味。 图2 所示，当温度为35 ℃时，果汁发酵适中，具有脐橙自身的风味和典型的发酵味，两种风味相互融合，饮品达到最优值为88.24分；温度升至38 ℃时，乳酸菌繁殖速率最大，活菌数为1.15×109CFU/mL，而温度在38～41 ℃时饮品中活菌逐渐下降。 全果汁发酵的最优温度为35℃。缓；然而，脐橙全果汁的发酵时间过长，导致果汁颜色褐变，酸甜比例失衡，口感粗糙，饮品风味差。图3 所示，当全果汁发酵24 h 时，乳酸菌增长至7.9×108CFU/mL，之后逐渐进入稳定期，饮品的感官特性为最优值88.35 分；到发酵后期，果汁中的糖大量消耗，发酵过度，饮品的感官和风味急剧下降。 全果汁发酵的最优时间为24 h。

图2 发酵温度与活菌数和感官评分的关系Fig.2 Relationship between fermentation temperature and viable count and sensory score

图3 发酵时间与活菌数和感官评分的关系Fig.3 Relationship between fermentation time and viable count and sensory score

2.1.4 接种量的影响 接种量过大，使饮品中的乳酸菌超过可容纳最适值，加速乳酸菌死亡，导致感官特性下降。 图4 所示，1%～3%接种量增加导致活菌数增加，果汁发酵未完全，使果香和发酵味较为寡淡；接种量3%～5%时，果汁中活菌数增加量趋于平缓，此时脐橙全果汁口感过酸，发酵风味过重，导致感官接受度差。全果汁的最优接种量为3%。

图4 接种量与活菌数和感官评分的关系Fig.4 Relationship between inoculation amount and viable count and sensory score

2.2 Box-Behnken 响应面优化

2.2.1 Box-Behnken 结果分析 应用Box-Behnken 设计17 组试验 （表3），分析不同温度（A）、时间（B）、接种量（C）条件下的活菌数（Y1）和感官评分（Y2），根据模型可得响应面的回归方程为：

表3 Box-Behnken 设计及结果Table 3 Box-behnken design and results

Y1=9.01-0.068A+0.11B+0.019C+0.12AB-0.043AC+0.005BC-0.071A2-0.043B2-0.089C2

Y2=85.03-4.52A-3.48B+1.11C+1.35AB+1.79AC+2.84BC-8.52A2-6.62B2-3.69C2

根据表4 和表5 可知，活菌数和感官评分模型均有差异极显著（P<0.0001），失拟项分别为0.2827>0.05 和0.2887>0.05 均差异不显著，且两个模型的R12=98.70%，R22=98.84%，说明模型用于此饮品发酵工艺参数的优化可信度高，拟合较好。由饮品中活菌数的方差分析可知，模型的A、B、AB、AC 及A2、B2、C2均存在极显著差异（P<0.01），一次项C 差异显著，而交互项BC 不显著。 对饮品中感官评分进行方差分析，模型A、B、BC 及A2、B2、C2均存在极显著差异（P<0.01），一次项C、交互项AC 差异显著，而交互项AB 不显著。 对模型中的F 值进行判断，对饮品中活菌数的影响排序为B（时间）>A（温度）>C（接种量），对感官特征影响排序为A（温度）>B（时间）>C（接种量）。

表4 活菌数方差分析Table 4 Analysis of variance of viable count

表5 感官评分方差分析Table 5 Sensory score analysis of variance

（续表3）

2.2.2 因素间交互作用分析 图5 显示不同因素间强、弱的等高线图和三维曲面图，响应面的陡峭程度决定该因素的影响程度。 图5a、5c、5e、5g 等高线横向跨度较大，且非圆形，表明因素间具有交互影响。 图5b、5h 相对5d、5f 较为陡峭，分析图形可知接种量对响应值均存在较小影响； 且随着各因素的增加，响应值增加到极值，然后随着各因素的增加而降低。 这与上述Box-Behnken 模型分析具有一致性。

图5 各因素间的交互关系Fig.5 The interaction between the factors

2.2.3 模型验证试验结果 在响应面试验设计的基础上，分析模型预测的最优发酵条件： 温度34.06 ℃、时间22.73 h、接种量3.03%，预测的响应值为活菌数9.01 lg（CFU/mL），感官评分86.14分。为了更好控制生产条件，取整后得到：温度34℃、时间23 h、接种量3%。 验证模型预测结果，测得饮品中实际活菌数为（8.91±0.11）lg（CFU/mL），感官评为84.8 分。 模型的验证试验重复性好，表明优化后的工艺参数对益生菌脐橙全果汁生产具有参考意义。

2.3 最佳发酵条件下脐橙全果汁的风味测定

益生菌脐橙全果汁中的挥发性成分变化主要是乳酸菌利用原料进行代谢，使原有香味物质增加或减少，并产生新的香味物质，如苯乙醇、香叶醇、3-羟基己酸乙酯等。采用GC-MS 技术，对发酵前、后的饮品进行风味分析，共鉴定出48 种香气物质。 由表6 可知，脐橙全果汁发酵后，醇类化合物的相对含量大量增加，部分物质是未发酵组的2 倍及以上，特别是α-松油醇相对含量提高至1.590%。 经益生菌作用后，酯类化合物种类减少，而总相对含量上升至2.050%，主要为3-羟基己酸乙酯；同时检测到新的醛类、酚类化合物，3，4-二甲基苯甲醛（0.232%）、5-羟甲基糠醛（0.240%）、4-乙基苯酚（0.071%）等均只在发酵果汁中出现。烯烃能被氧化为醇、醛酮等物质，与未发酵果汁相比，发酵果汁中酮类挥发性物质总相对含量增加了0.629%，而烯类化合物的总相对含量大幅降低了15.811%。 巴西伦亚橘烯相对含量降至15.980%，而（d）-柠檬烯相对含量大幅增至23.346%，且出现新的α-愈创木烯（0.455%）、α-律草烯（0.079%）。原汁相对含量最高的双戊烯，呈现松节油香，在发酵汁中并未被检测到。

表6 发酵前、后脐橙全果汁香气物质Table 6 Aroma of navel orange before and after fermentation

OAV 值不仅与嗅觉阈值有关，还受物质质量浓度的影响。 由表7 可知，醇类物质发酵后OAV值普遍增加，而呈现铃兰香、木香的芳樟醇含量下降，这是由于在发酵过程中，芳樟醇主要降解为α-松油醇，并有部分降解为香叶醇、橙花醇，使发酵后的饮品花香更浓郁；酯类物质阈值较低，发酵后3-羟基己酸乙酯含量上升，对脐橙全果汁风味影响较为明显，呈现水果香、菠萝香。其次，脐橙全果汁中的醛类物质不稳定，在发酵过程中将其还原为醇或氧化为酸，导致发酵后脐橙全果汁醛类物质种类减少。 左旋香芹酮是（d）-柠檬烯氧化产生的异位酮，而脐橙全果汁发酵后的（d）-柠檬烯含量大于未发酵的，因此赋予发酵果汁更多留兰香风味。脐橙中含有大量的烯类化合，如（d）-柠檬烯、月桂烯、（+）-α-蒎烯等。 （d）-柠檬烯广泛存在于脐橙果渣中，且发酵后全果汁的（d）-柠檬烯相对含量激增，呈现鲜橙子香、柠檬香。 发酵后月桂烯稍虽有减少，但仍是发酵果汁中的主要风味特征，赋予果汁草香及橙花油的风味，而（+）-α-蒎烯对发酵后橙汁的香气有积极贡献，呈现一定的松木、树脂的风味。这些来自脐橙汁本身的挥发性成分经乳酸菌的代谢，使呈香物质发生改变，赋予益生菌脐橙全果汁典型的风味。

表7 益生菌脐橙全果汁风味物质OAV 分析Table 7 OAV analysis of probiotic navel orange whole juice flavor compounds

（续表6）

（续表6）

3 结论

利用复合乳酸菌，建立崀山脐橙全果汁饮品的最优发酵工艺。 根据Box-behnken 试验结果，获得最优工艺条件为温度34 ℃，时间23 h，接种量3%，此时饮品中活菌数（8.91±0.11）lg（CFU/mL），感官评分84.8 分，生产的益生菌脐橙全果汁风味优良，浓郁饱满，回味悠长。

益生菌脐橙全果汁的挥发性风味成分主要来自本身的香气成分以及利用乳酸菌代谢，各类香气成分相互协调，形成饮品的最佳风味。 采用HSPME-GC-MS 检测发酵前、后的风味物质，共检出48 种风味成分。发酵果汁中（d）-柠檬烯为主香气成分，占23.346%，呈现鲜橙子香、柠檬香；其次，乳酸菌利用基质中的各类成分，在发酵时不断发生酯化反应、醇化反应等，使发酵后香气种类成分更复杂，含量更丰富，如苯乙醇、香叶醇、3-羟基己酸乙酯等。结合感官评价可知，发酵后的脐橙全果汁口感更柔顺，花果香更浓郁，并伴随有发酵产品的典型风味。