金华火腿中生物活性肽的抗高血压活性研究

邢路娟，左庆翔，郝月静，傅丽娟，张万刚

（南京农业大学食品科技学院 国家肉品质量安全与工程技术研究中心 南京 210095）

高血压是指血液在循环流动时，对血管壁造成的压力值持续高于正常值[1]。 据世界卫生组织（WHO）2019年统计显示，全世界估计共有11.3亿人患有高血压。从年龄结构来看，高血压患病人群已不再局限于中老年人，逐渐呈现年轻化趋势。由高血压引发的脑中风、动脉硬化、肾衰竭等病发症是导致高死亡率的重要原因。目前，常见的高血压控制药物如卡托普利等均需要长期服用，由此引发的副作用，如心悸、肾功能损害、失眠等，对生命健康带来潜在风险。因此，研发具有降血压作用的功能性营养因子来缓解高血压病情具有广阔的前景。 血管紧张素转化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE） 在高血压形成过程中发挥重要功能。 ACE 作用于血管紧张素I （Angiotensin I，Ang I）并将其转化为Ang II，引起动脉收缩，同时抑制缓激肽分解，导致机体血压上升[2]。 动物实验和临床试验表明，生物活性肽可通过抑制ACE 活性，达到降低血压的效果[3]。

干腌火腿是经过发酵成熟后的肉制品，其生产周期长，发酵成熟过程中产生的游离氨基酸、肽类物质赋予干腌火腿独特的产品品质[4]。干腌火腿主要产于中国及欧洲地中海地区，其中金华火腿、宣威火腿、如皋火腿是我国有名的三大火腿[5]。 在肌肉内源酶及微生物的作用下，干腌火腿的肌肉蛋白如肌动蛋白、肌球蛋白、肌钙蛋白等均可发生降解，从而生成多肽和游离氨基酸等成分[6]。 有研究表明，随着发酵周期的延长，干腌火腿中产生的肽逐渐增多，提取得到的肽类含量占肌肉总量的1.58%～6.26%[7]。 干腌火腿多肽被证实具有清除自由基，螯合金属离子，调节血管紧张素转化酶，抑菌等活性[8-10]。 祝超智等[11]验证了从金华火腿中提取的多肽具有清除羟基自由基、DPPH 自由基、螯合金属离子能力，与谷胱甘肽相比，具有显著抗氧化能力。 Dellafiora 等[12]报道意大利帕尔玛火腿中提取的肽类具有ACE 抑制活性，其中LGL 和SFVTT 肽段具有较强的ACE 抑制活性。Mora 等[13]发现伊比利亚干腌火腿是天然抗高血压肽的来源，在自发高血压大鼠体内具有显著降低收缩压的功能。与西式干腌火腿相比，中式干腌火腿在加工工艺、发酵环境等方面均有不同，从中提取的生物活性肽的种类及生物活性也存在差异。目前，关于中国传统干腌火腿来源多肽的降血压活性研究还未见报道。 为探究干腌火腿多肽的高血压调节功能，本研究以金华火腿为原料提取多肽，采用体外、体内试验进行抗高血压活性研究，为进一步丰富干腌火腿的功能性提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

pH 计 （FE20），瑞 士Mettle Toledo 公 司；GM200 刀式研磨仪，德国Retsch 公司；T25 匀浆机，德国IKA 公司；Avanti J-E 高速离心机，美国Beckman Coulter 公司；ES2030 冷冻干燥机，日本Hirachi 公司；多功能酶标仪SpectraMaxRM2e，美国Molecular Devices 公司；MRB-ⅢA 型电脑大鼠血压心率测定仪，上海高血压研究所；Oasis HLB 固相萃取柱，美国Waters 公司。

1.2 材料与试剂

自发性高血压大鼠（SHR）购于上海斯莱克实验动物有限公司，共计20 只（SPF 级、12 周龄的雄性鼠）。 每只大鼠单笼饲养，放置饮水瓶和足够的维持饲料，让大鼠自由进食和饮水，培养室内温度为25 ℃，相对湿度为60%。

金华火腿，金华金年火腿有限公司；血管紧张素转化酶、胰酪蛋白胨、肾素检测试剂盒，Sigma-Aldrich 公司；氢氧化钠、磷酸二氢钠、盐酸、氯化钠、 十二烷基硫酸钠 （Sodium dodecyl sulfate，SDS）、甲醇、邻苯二甲醛、乙醇、β-巯基乙醇、醋酸乙酯、硼砂，国药集团化学试剂有限公司；卡托普利，上海源叶生物科技有限公司。以上试剂均为分析纯级。

1.3 试验方法

1.3.1 金华火腿中粗肽的提取 金华火腿中多肽的提取方法参考胡亚亚等[14]的研究。 将火腿肌肉分割成小块放入研磨仪中绞碎。 称取碎肉粒25 g盛入500 mL 离心瓶中，并加入100 mL 磷酸缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.0），随后进行匀浆处理（转速18 000 r/min，匀浆时间12 s，间歇时间15 s）。 将匀浆液置于4 ℃静置2 h 后，再次离心（温度4 ℃，12 000×g，时间20 min），随后取出上清液。 将上清液中的脂肪滴、肉糜等杂质过滤后，加入3 倍体积的40%（体积分数）乙醇，然后将混合溶液于4 ℃静置8 h 后离心（4 ℃，12 000×g，20 min）得到多肽上清液。 最后将冷冻干燥的多肽粉末放置于-20℃冰箱中保存。

1.3.2 肽浓度的测定 肽浓度测定方法参照Church 等[15]并作适当改进。 在避光条件下配制邻苯二甲醛混合液，取80 mg 邻苯二甲醛溶解于1 mL 甲醇中，依次加入50 mL 硼砂溶液（100 mmol/L），5 mL SDS（20%）和200 μL β-巯基乙醇，最后用去离子水将溶液总体积定容至100 mL。 邻苯二甲醛混合液现用现配。取150 μL 的多肽样品与2 mL 邻苯二甲醛混合液混匀，室温下避光孵育2 min，在340 nm 波长处测定吸光值。同时配制含量为0，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL 的胰酪蛋白胨作为标准品，绘制标准曲线，计算火腿多肽样品中的肽浓度。

1.3.3 粗肽提取物脱盐 使用固相萃取柱Oasis HLB 20 cc 对提取的多肽样品进行脱盐处理，具体过程参照Escudero 等[16]的方法。首先活化柱体，用蒸馏水淋洗萃取柱，再将提取的2.5 mL 多肽溶液（1 mg/mL）注入柱体；随后使用蒸馏水洗脱萃取柱，洗脱量为柱体积的3 倍容量，最后使用50%（体积分数） 甲醇溶液将洗脱液收集到5 mL 离心管。洗脱液经过旋转蒸发浓缩后再冷冻干燥，得到的肽粉置于-20 ℃保存。

1.3.4 肾素抑制活性的测定 肾素抑制活性测定方法参考肾素检测试剂盒MAK157-1KT （Sigma-Aldrich）。

1.3.5 动物实验 SHR 适应环境1 周后进行分组试验。 将20 只SHR 大鼠分为如下4 个处理组：

空白对照组（C）：灌胃磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.0）；药品对照组（DC）：灌胃质量浓度为5 mg/mL 的卡托普利溶液；低肽浓度组（LP）：灌胃质量浓度为10 mg/mL 的粗肽溶液； 高肽浓度组（HP）：灌胃质量浓度为20 mg/mL 的粗肽溶液。

灌胃剂量根据大鼠体质量进行换算 （5 mL/kg），灌胃后每隔2 h 测定SHR 大鼠的心率、收缩压以及舒张压，分别记录灌胃后2，4，6，8，10，12 h 的血压数据。 相同时间点同一只鼠的血压指标重复测量3 次，最终结果取平均值。

1.4 数据统计与分析

试验过程中所得数据使用SAS 8.0 进行分析，方差分析方法使用One-Way ANOVA，采用邓肯多重比较，显著性检验标准为P<0.05，极显著性检验标准为P<0.01。 半抑制浓度（IC50）的分析使用SPSS 23.0 软件。

2 结果与分析

2.1 金华火腿中的多肽含量及体外抗高血压活性

在干腌火腿发酵成熟过程中，肌肉蛋白质在内源酶及微生物的作用下发生水解并产生丰富的肽类物质。前期研究显示，干腌火腿中肽的含量与发酵周期密切相关[17]。 Zhu 等[18]采用盐酸浸提的方法得到金华火腿中多肽含量为1.16%。 发酵周期为16 个月的宣威火腿中多肽含量为3.44%[19]。 由表1 可知，使用磷酸盐法提取的金华火腿中，生物活性肽含量高达12.19%。 本试验的金华火腿中较高的肽含量可能与火腿较长的发酵周期有关，多肽含量的增加为研究其生理调节活性奠定了基础。

表1 金华火腿中的肽含量Table 1 Peptides contents in Jinhua dry-cured ham

体内肾素-血管紧张素系统 （Renin-angiotensin system，RAS）是机体的升压系统，激肽释放酶-激肽系统（Kallikrein-kinin system，KKS）是机体的降压系统，两者在调节血压的过程中存在拮抗关系，只有当两者达到动态平衡时，机体的血压才能维持正常水平。 ACE 主要通过参与体内循环系统来影响机体血压[20]。 当机体血压降低后，流经肾脏的血液量减少，肾脏将分泌肾素进入血液，血管紧张素原在肾素作用下产生Ang Ι，Ang Ι 进入血循环后在ACE 作用下裂解为Ang II，Ang II 具有强收缩血管的作用；同时Ang II 可促进醛固酮产生，刺激肾上腺素释放和Na+重吸收，导致血压升高[7]。 在KKS 系统中，激肽原在激肽释放酶的作用下产生舒缓激肽（Bradykinin，BK），进而刺激血管壁释放出具有强作用的血管舒张因子，从而扩张毛细血管使血压降低。 ACE 则可以通过切除部分活性位点使BK 失活，导致血压升高[21]。 从高血压形成的过程可知，有效控制ACE 的活性是缓解血压升高的有效途径。前期研究发现，牛肉蛋白[22]、骨胶原蛋白[23]、鱼皮明胶[24]等蛋白水解后提取的生物活性肽均具有ACE 抑制活性。 在SHR降压试验中，鲑鱼皮明胶中鉴定得到的2 条ACE抑制肽GLP 和LP，均可显著降低SHR 的收缩压[24]。在金华火腿多肽的稳定性研究中，其ACE 抑制率随着肽质量浓度的增加而提升，当肽质量浓度低于2.5 mg/mL 时，ACE 抑制率增长速率最快，超过2.5 mg/mL 时，增长速率逐渐降低；在肽质量浓度为10 mg/mL 时，ACE 抑制率最高为53.53%[25]。 在本试验中，火腿多肽的肾素抑制率也随着质量浓度的升高逐渐增强 （图1）。 当肽质量浓度为10 mg/mL 时，肾素抑制率达到62.21%。 通过拟合公式可以计算得到火腿多肽的IC50值为6.69 mg/mL。 以上结果初步证明了火腿多肽具有潜在的血压调节功能。

图1 金华火腿粗肽提取物的肾素抑制能力Fig.1 The renin inhibitory activity of peptides extracted from Jinhua dry-cured ham

2.2 动物体内的降血压效果

实验动物选取SHR 大鼠，通过与高血压药物（卡托普利）对比，探究灌胃金华火腿多肽对SHR大鼠的血压调节功能，测量灌胃后不同时间点的心率、收缩压、舒张压等指标。

2.2.1 金华火腿粗肽提取物对大鼠心率的影响高血压与心率变化密切相关，心率加快会增加高血压的风险，高血压患者的临床症状也通常伴随心率的升高。 静息心率的增加反映了机体内交感神经系统持续兴奋，系统过度驱动将对多部位的器官及其相应功能产生不利影响[26]。 已有研究表明，高血压患者静息心率加快，可导致血管、心脏、肾脏损伤，进而影响机体的正常功能[27]。 降血压药物进入机体血液循环后会对心率造成一定程度的影响[28]。 由图2a 可知，当给SHR 大鼠以低肽质量浓度10 mg/mL 进行灌胃时，各时间点测得SHR大鼠心率与空白组相比并无显著差异（P>0.05）。从图2b 可以看出，高质量浓度20 mg/mL 灌胃后，SHR 大鼠在2 h 和6 h 的心率显著低于空白对照组（P<0.05）。 从图2c 可以看出，卡托普利灌胃后，SHR 大鼠的心率在2～6 h 内显著低于空白对照组，其中SHR 大鼠心率在灌胃2 h 与4 h 后呈极显著降低（P<0.01）。 较高浓度的粗肽提取物表现出了降低心率的活性，虽在灌胃2 h 和4 h 后效果不及药物对照组，但在灌胃后8 h 高肽浓度组SHR 大鼠心率显著低于药品对照组（P<0.05）。由此可知，高浓度多肽灌胃对心率的控制作用更为稳定。

图2 金华火腿粗肽提取物对SHR 大鼠心率的影响Fig.2 Effect of peptides extracted from Jinhua dry-cured ham on the heart rate of SHR after intragastric administration

2.2.2 金华火腿粗肽提取物对大鼠收缩压的影响

收缩压是指当心脏收缩时，血液由心脏流向四肢时血液对血管的压力。 当收缩压持续≥140 mmHg（压力21.3 kPa）则可诊断为高血压[29]。 收缩压是反应机体血压变化的最重要指标。Fatani 等[30]研究表明高血压患者收缩压的变化，可作为独立预测重大心血管疾病风险的依据。由图3 可知，低肽质量浓度组、高肽质量浓度组、药品对照组在灌胃后的2～10 h，均有显著降低收缩压的效果，测量值均显著低于空白对照组（P<0.05）。 低肽质量浓度组在灌胃2 h 后，对大鼠收缩压的控制能力较弱，随后对收缩压的控制效果逐渐增强。 在8 h后，多肽灌胃处理的两组大鼠均呈现较低的收缩压，且与空白组的差异极显著（P<0.01）。在4～10 h 内，多肽与卡托普利处理组的收缩压均极显著低于空白组（P<0.01），且3 个处理组之间无显著差异（P>0.05）。 由此可知，与卡托普利相比，高肽质量浓度组对SHR 大鼠收缩压的调节作用呈延缓降低的趋势，即卡托普利可在给药2 h 内实现快速降压，而在6 h 得到最佳效果，多肽灌胃后则在8 h 达到最佳降压效果。

图3 金华火腿粗肽提取物对SHR 大鼠收缩压的影响Fig.3 Effect of peptides extracted from Jinhua dry-cured ham on the systolic blood pressure of SHR after intragastric administration

2.2.3 金华火腿粗肽提取物对大鼠舒张压的影响

舒张压是指在心脏舒缓状态下，动脉血管壁回缩时产生的压力，正常状态下舒张压应介于60～90 mmHg（12 kPa）。 金华火腿多肽对SHR 大鼠舒张压的影响如图4 所示。 低肽质量浓度组SHR 大鼠的舒张压略低于空白对照组，然而并无显著性差异（P>0.05）；在灌胃4～10 h 内，高质量浓度组大鼠的舒张压显著低于空白组（P<0.05），其中在6 h 和8 h 时，呈极显著降低趋势（P<0.01）；在灌胃2～6 h 内，卡托普利对大鼠的舒张压呈极显著降低趋势（P < 0.01），其余时间无显著变化（P >0.05）。 由此可见，卡托普利降低舒张压见效快，然而高浓度粗肽提取物可在更长时间内维持舒张压在较低水平，作用效果显著。火腿多肽在生物体内发挥作用时间晚于卡托普利，可能因为与多肽的吸收过程相关。有研究显示，生物活性肽在体内经消化后会产生更短的多肽，而特定序列的短肽具有较强的降压活性[31]。

图4 金华火腿多肽对SHR 大鼠舒张压的影响Fig.4 Effect of peptides extracted from Jinhua dry-cured ham on the diastolic blood pressure of SHR after intragastric administration

综合以上指标可知，高肽质量浓度 （20 mg/mL）的火腿多肽与5 mg/mL 卡托普利的降血压功效相近，同时火腿多肽的降压作用延迟于卡托普利，且降压作用持续更长。造成这一现象的潜在原因如下：在生物体中，消化系统中的胃蛋白酶、胰蛋白酶等将火腿多肽进一步水解，生成具有降血压活性的肽段进而被消化吸收，然后发挥体内降血压作用。金华火腿多肽中肽成分复杂，降血压活性肽的结构功能存在较大差异，部分生物活性多肽可能发挥药物前体作用。

3 结论

在体外降血压活性研究中，金华火腿多肽呈现出较强的肾素抑制活性，其IC50值为6.69 mg/mL。 在SHR 大鼠体内实验中，通过灌胃不同质量浓度的火腿多肽与卡托普利进行对比发现，火腿多肽具有显著调节大鼠心率、收缩压、舒张压的功能。 当灌胃质量浓度为20 mg/mL 时，大鼠的收缩压与舒张压在8 h 后呈现最佳抑制效果，而心率指标则恢复正常。与卡托普利相比，高质量浓度多肽的血压调节功能更显著，且时间更长。以上研究证实了金华火腿多肽具有体外调节肾素活性的功能，同时在高血压大鼠的灌胃实验中具有降血压功效，以上结果为开展火腿多肽的体内生理调节功能研究奠定了基础。