曲霉半乳甘露聚糖磁微粒化学发光法检测体系的建立及评价①

马梦男 高欣欣 刘春龙 张舟 王梦凡（天津大学化工学院，天津 300072）

近年来由于抗生素、激素、免疫抑制药的不恰当使用导致人体免疫力低下抗真菌感染能力大大减弱，致使侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）的患病率和病死率逐年增长。其中中性粒细胞缺乏、器官移植及血液病/恶性肿瘤、慢性阻塞性肺病、免疫缺陷等是导致IA的高危因素［1］。在流行病学上，曲霉菌属于机会性感染真菌，曲霉孢子从呼吸道吸入，在肺部形成病灶造成侵袭性肺部曲霉感染（invasive pulmonary aspergillus infections，IPAI）［2-3］。其中半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）是曲霉细胞壁表达释放的一种特异性多糖即曲霉半乳甘露聚糖，生长时会由菌丝的顶端释放到外界环境中。GM抗原被公认为曲霉感染后首先释放到血液的标志物，其释放量与曲霉量成正相关，可代表患者的曲霉感染程度，因此曲霉特异性表达抗原GM的检测对IA的早期诊断具有极为重要的意义［4-6］。

目前传统的微生物学培养、组织病理学及影像学检查仍是诊断曲霉菌的金标准，但真菌微生物培养耗时长、组织病理学有创检测敏感性和精确性较低。影像学检查特异性低难以与肺部的其他感染区分，对早期临床诊断指导意义有限。近年来随着分子生物学和生物传感器技术的进步，分子生物学方法RT-PCR、恒温扩增等技术广泛用于侵袭性真菌的诊断。但真菌细胞壁由几丁质、葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白组成，结构成分复杂。曲霉细胞壁DNA较难提取，致使真菌核酸诊断不能在临床上广泛使用。血清学检测可作为传统方法及分子生物学的重要补充。目前临床实验室主要利用GM实验（ELISA）检测GM，临床上也常用1，3-β-D葡聚糖（G实验）和GM实验联合检测患者体内特异性GM，但ELISA检测时间长，操作步骤繁琐，敏感性和特异性变化较大［7-9］。为了弥补ELISA检测的缺陷，本文利用仪器自动化平台和免疫测定技术，建立了GM磁微粒化学发光法（CLIA）检测体系［10］。CLIA中悬浮性磁微粒作为固相载体具有较高的比表面积，整个免疫反应在均相体系中进行，增大了抗原与抗体特异性结合的概率，大大提高反应特异度和灵敏度；另外自动化设施的应用，使检测更加快速、准确，在生命科学、临床医学以及环境、药物等领域广泛应用。基于此，本文针对曲霉菌感染所产生的GM抗原标志物，研究开发出一种特异性强、灵敏度高、检测时间短、自动化操作的CLIA检测方法［11-12］。并对该方法性能指标进行评价，为IA感染临床诊断提供技术支持［13］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器GM、荚膜多糖抗原（glucyro⁃noxylomannan，GXM）、甘露聚糖抗原（mannosan，MN）购自天津丹娜（生物）科技股份有限公司；Plate⁃liaTM曲霉菌抗原检测试剂盒购自Bio-Rad公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。全自动化学发光分析仪SMART 6500购自重庆科斯迈生物科技有限公司；酶标仪购自帝肯奥地利有限责任公司；HDL生物安全柜购自北京东联哈尔仪器；DS-11超微量紫外/可见分光光度计购自美国DeNovix公司。

1.1.2 实验动物新西兰大白兔（2~3 kg/只）由北京隆安实验动物养殖中心提供和饲养，动物合格证号为SCXK（京）2019-0006。

1.1.3 血清标本收集天津胸科医院曲霉血清阳性样本100份，健康人血清标本220份。

1.2 方法

1.2.1 动物免疫及血清效价测定将GM抗原的生理盐水稀释液与等比例的弗氏完全佐剂（初免）和不完全佐剂（后续免疫）乳化混匀，采用皮下注射法免疫新西兰兔，2次加强免疫后对兔耳动脉采血离心得到抗血清，使用间接法测定血清中特异性抗体的效价。用0.02 mol/L PBS倍比梯度稀释抗血清从1∶1 000开始直至稀释到1∶512 000，稀释液4℃保存备用。然后分别包被GM、GXM、MN酶标板；采用酶联免疫间接法测定上述稀释液的吸光值A（450 nm/620 nm）。将A值在1.0附近的抗血清的稀释倍数作为效价。

1.2.2 多克隆抗体制备及电泳鉴定将获得的抗血清离心后，上清用55%饱和硫酸铵2次盐析，再用0.02 mol/L PBS 4℃过夜透析，将透析产物采用Protein A琼脂糖凝胶亲和层析，获得高纯度的多克隆抗体，并用SDS-PAGE电泳鉴定其分子量。使用超微量紫外/可见分光光度计测其浓度。

1.2.3 GM磁微粒化学发光检测体系的建立

1.2.3.1 磁微粒体系的制备将混匀的链霉亲和素磁珠在磁微粒架上静置，待磁微粒全部沉降后，弃去上清，加入3倍磁微粒缓冲液（0.02 mol/L PBS，0.5%Tween20）混匀，静置，洗涤。用0.02 mol/L PBS稀释液将链霉亲和素磁珠溶液配制成1 mg/ml的母液，混匀放置2~8℃冰箱备用。

1.2.3.2 生物素标记抗GM抗体的制备将抗GM与生物素水溶液按质量10∶1比例混合避光，室温反应1~2 h。0.02 mol/L PBS透析过夜，每隔2 h透析1次，透析5次。收集透析产物，最终用0.02 mol/L PBS的稀释液配制成1μg/ml的母液，混匀放置2~8℃冰箱备用。

1.2.3.3 吖啶磺酰胺标记抗GM抗体的制备将抗GM抗体与活化吖啶磺酰胺按照质量10∶1比例混匀避光，室温反应45 min。加一定体积15%赖氨酸终止液，混匀避光，室温反应45 min后透析，透析方法同1.2.3.2。收集透析产物，最终用0.02 mol/L PBS的稀释液配制成5μg/ml的母液，混匀放置2~8℃冰箱备用。

1.2.4条件优化

1.2.4.1 磁微粒浓度的选择选择最优磁微粒浓度，设置不同浓度梯度：0.1、0.5、1.0 mg/ml，将阳性和阴性检测信号发光值的比值（P/N）作为考核指标。

1.2.4.2 捕获抗体浓度的选择选择最优捕获记抗体浓度，设置不同浓度梯度：0.2、0.5、1.0μg/ml，在阴性血清里添加不同梯度曲霉抗原，测定其检测信号发光值大小和相关性。

1.2.4.3 检测抗体浓度的选择选择最优检测抗体浓度，设置不同浓度梯度：1.25、2.5、5.0μg/ml，在阴性血清里添加不同梯度曲霉抗原，测定其检测信号值大小和相关性。最终筛选区分较大的生物素标记抗体与吖啶磺酰胺标记抗体组合对，建立最优体系。

1.2.5 分析性能评估

1.2.5.1 准确度回收率评估方法如下：选择高值参考品1份，按1∶9的比例加到低值参考品中，回收标本平行检测3次求均值，计算回收率。回收率R（%）=［C×（V0+VS）-C0×V0］/（CS×VS）×100%（V0：低值参考品的体积，VS：高值参考品的体积，C：回收标本的检测浓度，C0：低值参考品的检测浓度，CS：高值参考品的检测浓度）。

1.2.5.2 精密度批内精密度（也称重复性）用3个不同批次高、中、低标本各重复检测10次，批间精密度用3个不同批次高、中、低标本重复检测10次。计算批内精密度和批间精密度。

1.2.5.3 分析灵敏度准备5个接近零浓度样本分别用3批试剂盒检测3 d，每个样本每天做4个重复（同一设备检测）；准备5个低检测浓度样本（1~5倍预期的LoB）分别用3批试剂盒检测3 d，每个样本每天做4个重复（同一设备检测）；准备5份浓度范围1~4倍的LoB之间的标本，每天各检测4次，间隔≥2 h，每个指标重复2次，共进行5 d。结果分析计算LoB和LoD。

1.2.5.4 线性范围将超过预期线性区间（0.15~50 ng/ml）上限的高值参考品L1与低于线性区间下限的低值参考品L2按照一定比例稀释为11个浓度的样品；对每一浓度样品平行测定3次，计算平均检测浓度（Xi），计算理论浓度Ci=C1×V1+C2×V2/V1+V2（其中Ci为样品i的理论浓度；C1为高值线性参考品L1的参考浓度；V1为样品i中高值线性参考品L1的体积；C2为低值线性参考品L2的参考浓度；V2为样品i中低值线性参考品L2的体积），最终计算出线性范围。

1.2.5.5 一致性比较采用SPSS22.0软件对伯乐试剂盒和本研究开发的GM CLIA进行分析。对临床健康人血清及曲霉确诊样本的阴阳性符合情况进行Kappa一致性分析。Kappa系数≥0.75，认为两试剂盒检测结果呈现高度一致；0.4≤Kappa系数<0.75，认为两试剂盒检测结果一致，基本等效；Kap⁃pa值<0.4则认为两试剂盒检测结果不一致。

1.3 统计学处理采用SPSS22.0软件和Excel软件进行数据分析。

2 结果

2.1 抗血清效价测定和交叉实验本研究利用GM作为抗原免疫多只新西兰兔，通过ELISA间接法筛选获得分泌针对GM的多克隆抗体。由图1可知，选择吸光值在1.0附近的稀释倍数为抗体效价，可知该法获得的多克隆抗体效价为1×104~1×105，且与GXM、MN无交叉反应。

图1 间接ELISA法测定抗GM多克隆抗体效价Fig.1 Determination of anti-GM polyclonal antibody titer by indirect ELISA

2.2 抗GM多克隆抗体电泳鉴定由SDS-PAGE电泳可知（图2），抗GM多克隆抗体蛋白其分子量为25~55 kD。使用超微量紫外/可见分光光度计直接测得多克隆抗体蛋白浓度为1.87 mg/ml。

图2 GM抗体SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of aspergillus GM anti⁃body

2.3 条件优化结果

2.3.1 磁微粒浓度的选择由表1可知，磁微粒浓度在0.5 mg/ml阴阳区分最大且本底值最低，故选择0.5 mg/ml为磁微粒最优浓度。

表1 磁微粒浓度条件优化Tab.1 Optimization of magnetic particle concentration conditions

2.3.2 捕获抗体浓度的选择由图3可知，随着捕获浓度由0.2μg/ml增加到0.5μg/ml，检测发光值明显升高；当捕获抗体的浓度增加至1.0μg/ml时，检测发光值未见升高。表明捕获抗体为0.5μg/ml时捕获抗体能够充分捕获到样本待测物GM抗原并与之充分反应。因此选择捕获抗体最优浓度为0.5μg/ml。

图3 GM CLIA法捕获抗体浓度优化检测抗体Fig.3 Optimization of capture antibody concentration by GM CLIA method antibody detection

2.3.3 检测抗体浓度的选择由图4可知，随着检测抗体浓度由1.25μg/ml增加到2.50μg/ml，检测发光值明显升高；当检测抗体的浓度增加至5.00μg/ml时，检测发光值没有升高，反而总体呈下降趋势。表明检测抗体为2.05μg/ml时，信号值已达到饱和状态。因此选择检测抗体的最佳浓度为2.50μg/ml。捕获抗体0.50μg/ml，检测抗体2.50μg/ml。

图4 GM CLIA法检测抗体浓度优化Fig.4 Optimization of antibody concentration by GM CLIA method

2.4 分析性能评估

2.4.1 准确度由表2可知，所测的10个回收标本其回收率在（100±15）%，符合需要。实验中10个标本的回收率均在允许误差范围内，故此方法的回收率满足要求。

表2 GM CLIA法试剂回收率检测结果Tab.2 Test results of reagent recovery by GM CLIA method

2.4.2 精密度由表3可知，对3个不同批次高，中，低值参考品标本分别测试，分析内精密度，分析间精密度均<10%。

表3 GM CLIA法试剂精密度结果（n=10）Tab.3 Reagent precision results of GM CLIA method（n=10）

2.4.3 分析灵敏度对灵敏度测试结果进行分析计算，得到LoB、LoD分别为0.05、0.08 ng/ml。

2.4.4 线性范围由表4可知，10个标本实际所测浓度与理论浓度相对偏差均<10%，且其线性相关性较好。因此本研究建立的检测体系线性范围为0.15~50.00 ng/ml。

表4 GM CLIA法试剂线性范围检测结果Tab.4 Results of linear range detection of GM CLIA reagent

2.4.5 一致性比较由表5可知，将两种测试结果转化为阴阳性符合情况进行分析，Kappa系数0.88>0.75，因此可认为本研究GM CLIA试剂盒与伯乐试剂盒显示出高度一致性。

表5 GM CLIA法试剂一致性分析Tab.5 Reagent consistency analysis of GM CLIA method

3 讨论

本研究基于GM对新西兰兔进行免疫，获得抗GM多克隆特异性抗体效价在1×104~1×105，能够特异性识别GM且与GXM、MN无交叉反应。通过SDS-PAGE，测得其分子量在25~55 kD左右。从而筛选出了性能较好的抗GM多克隆抗体［13-14］。基于CLIA系统，本文建立了GM CLIA法定性检测。以期实现快速、高灵敏性、高特异性、高准确度，线性范围宽的自动化检测，为GM快速临床诊断提供有力依据。

本文研制的GM试剂盒回收率在（100±15）%以内，符合要求。分析内精密度、分析间精密度均<10%，精密度较好。线性范围在0.15~50.00 ng/ml，相比较曲霉菌检测有更广的线性区间。分析灵敏度LoB、LoD分别为0.05 ng/ml、0.08 ng/ml。Kappa系数0.88>0.75，与伯乐试剂盒具有很好的一致性。不足之处在于本研究尚处于初步开发阶段，该方法的体系性能指标还需进一步评估。如果GM CLIA法检测体系能够广泛应用临床诊断中，必将大大提高GM检测的特异度和灵敏度。有利于GM的早期诊断及治疗效果评价［15］，可实现对高危人群曲霉感染的动态监测，可对抗真菌治疗提供用药依据和药效学评价，具有较好的推广运用价值。