蚓激酶对哮喘小鼠免疫相关转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3的影响①

韩兆鹏 薛征 杨艳 胡逸中 周欢 刘亚尊（山西中医药大学，太原 030024）

支气管哮喘（简称哮喘）作为一种气道慢性炎症性疾病，免疫细胞失衡导致的炎症反应失控是其关键机制之一。Th1/Th2与Th17/Treg失衡在气道炎症中发挥重要作用［1-2］。IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α可诱发T细胞免疫失衡，而T-bet、GATA-3、RORγt和Foxp3分别作为免疫细胞Th1、Th2、Th17和Treg的特异性转录因子调控初始CD4+T细胞向Th1、Th2、Th17和Treg分化［3-4］。炎症因子与转录因子一定程度上可反映Th1/Th2、Th17/Treg免疫平衡情况，判断气道炎症程度。通过改善Th1/Th2与Th17/Treg平衡缓解过敏性症状是哮喘治疗的重要策略。蚓激酶作为中药地龙中提取的一组丝氨酸蛋白水解酶，具有抗凝纤溶、抗纤维化、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等药理作用。研究显示，蚓激酶可抑制白细胞介素-1受体相关激酶-4（interleukin-1 receptor-associated kinase-4，IRAK4）活化及NF-κB、MAPKs表达缓解炎症反应［5］，但蚓激酶在哮喘气道炎症方面的研究较少。本研究拟观察蚓激酶对哮喘小鼠炎症因子IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α和细胞转录因子T-bet、GATA-3、RORγt及Foxp3的影响，探讨蚓激酶对哮喘小鼠Th1/Th2和Th17/Treg平衡的调节作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物4~6周龄健康SPF级BALB/c雄性小鼠40只，体质量18~22 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：20170005019743，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，经上海市中医医院动物伦理委员会批准（dw2020003），饲养于上海市中医医院SPF级动物房，20~24℃、50%~70%湿度、IVC-Ⅱ型独立送风笼具中饲养，自由饮水与进食，适应性喂养1周。

1.1.2 药物与试剂醋酸地塞米松片（0.75 mg/片，上海上药信谊药厂有限公司，批号：HB102079）；蚓激酶（≥12 000 U/mg，上海国源生物技术有限公司，批号：20190105）；OVA（Sigma，货号：A5503）；Al（OH）3（Thermo，货号：77161）；苏木素、伊红溶液（BASO，货号：714094、BA4099）；甲醛、二甲苯、异丙醇、无水乙醇、氯仿（国药集团，货号：10010018、10023418、80109218、100092680、10023419）；IL-6、IL-1β、TGF-β、TNF-αELISA试 剂 盒（X-Y Biotechnology，货 号：XY-E20012、XY-E20533、XY-E20217、XY-E20220）；Trizol（Invitrogen，货号：1596-026）；BCA蛋白定量试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒（Thermo，货号：PIC⁃PI23223、#K0223）；逆转录试剂盒（Fermentas，货号：#K1622）；蛋 白 预 染Marker（Fermentas，货 号：SM1811）；DEPC处理水、RIPA组织细胞快速裂解液、4×蛋白上样缓冲液、TEMED（上海基尔顿生物，货 号：R1600、BYL40825、BYL40828、BYL40728）；Tween20（Amresco，货号：BYL40713）；发光液（Milli⁃pore，货号：WBKLS0100）；RORγt（Bioss，货号：Bs-6217R）；Foxp3（Abcam，货 号：Ab23683）；T-bet、GATA-3（Proteintech，货号：13700-1-AP、66400-1-Ig）；GAPDH抗体（CST，货号：#5174）；羊抗兔HRP标记的二抗（碧云天，货号：A0208）。

1.1.3 仪器正置显微镜（Nikon公司，ECLIPSE Ni）；石蜡切片机、摊片机（徕卡公司，SQ2125、PPTHK-21B）；恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司，DHG-9023A）；显微图像分析系统（Nikon公司，DS-Ri2）；Real-time检测仪（ABI公司，ABI-7300）；低温冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，TG-16M）；旋涡振荡器（青浦泸西仪器厂，K30）；电动匀浆机（FLUKO，PRO200）；酶标仪（芬兰雷勃酶标仪，MK3）；电泳仪（Bio-Rad公司，mini protean 3 cell）；电转仪（大连竞迈科技有限公司，PS-9）；移液器（吉尔森P型移液器，Pipetman）；水浴锅（Leica，HI1210）；成像系统（Tanon，Tanon-5200）；超声雾化器（PARI GmbH，PARI BOY N）。

1.2方法

1.2.1 药物配制10 g OVA、1 g Al（OH）3溶于100 ml生理盐水，制成10%致敏液；蚓激酶以1.75 g/（kg·d）溶于pH=6的PBS；醋酸地塞米松片溶于生理盐水配制成0.075 mg/ml溶液。

1.2.2分组、造模及给药40只SPF级BALB/c雄性小鼠随机分为空白对照组（空白组）、哮喘模型组（模型组）、地塞米松组（地米组）、蚓激酶组，每组10只。造模第1、14天，模型组、地米组和蚓激酶组小鼠腹腔注射致敏液（0.5 ml/只），第21~27天将小鼠置于5 L密闭容器，雾化吸入5%OVA激发，40 min/次，1 d/次。空白组腹腔注射及超声雾化均以等量生理盐水代替。4组小鼠每次雾化激发1 h后，蚓激酶组灌胃给予蚓激酶［20 ml/（kg·d）］，地米组灌胃给予等量地塞米松，空白组和模型组灌胃给予等量生理盐水。

1.2.3 标本留取各组小鼠末次灌胃24 h后脱颈处死，结扎右侧支气管，左侧主支气管以1.5 ml生理盐水灌洗，收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveo⁃lar lavage fluid，BALF），离心取上清；右侧肺上叶用10%甲醛固定，HE染色，制备肺组织切片；右侧肺下叶剪碎制成匀浆，进行RT-PCR和Western blot检测。1.2.4 HE染色观察肺组织病理变化右侧肺上叶以10%甲醛固定48 h，流水冲洗，梯度乙醇脱水，置于无水乙醇和二甲苯混合液2 h，二甲苯脱水透明，浸蜡、包埋、切片，烤片、水化，HE染色，透明，封片，显微镜拍照，采集分析样本相关部位。

1.2.5 ELISA测定BALF上清IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平取BALF上清分装，按ELISA试剂盒说明书操作，测定450 nm处吸光度，通过标准品吸光度（A）绘制标准曲线，计算标本中IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α实际浓度。

1.2.6 RT-PCR检测肺组织T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3 mRNA表达取适量右肺组织匀浆，按试剂盒说明书操作。Trizol法提取总RNA，消除总RNA中的DNA后反转录合成cDNA第一条链，反应体系（25μl）：RNA-Primer Mix 12μl、5×RT Reaction Buffer 5μl、25 mmol/L dNTPs 1μl、25 U/μl RNase Inhibitor 1μl、200 U/μl M-MLV Rtase 1μl、RT引物1μl、ddH2O 4μl，反 应 程 序：37℃60 min、85℃5 min、4℃5 min，-20℃保存。对cDNA进行PCR扩增，反应体系（25μl）：SYBR Green Mix 12.5μl、正向 引 物0.5μl、反 向 引 物0.5μl、ddH2O 9.5μl、cDNA模板2μl，95℃10 min（95℃15 s；60℃45 s）40个循环、95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s、60℃15 s。数据分析采用仪器自带分析软件ABI Prism 7300 SDS Software，以GAPDH为 内 参，2-ΔCt计 算mRNA相对表达。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.2.7 Western blot检测肺组织T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3蛋白水平取适量右肺组织匀浆，按试剂盒说明书操作，组织匀浆完全裂解后离心取上清，蛋白定量，根据标准曲线求出相应样品蛋白实际浓度，制胶、上样、电泳，在25 V的半干式电转缓冲液（48 mmol/L Tris、39 mmol/L glycine、0.04%SDS、20%甲醇）中转膜30 min，室温下置于丽春红染色工作液中摇动染色5 min，封闭，孵育抗原，根据说明书将抗体稀释后4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗（1∶1 000稀释）37℃孵育1 h，TBST洗涤3次，与配制的ECL发光液混合显色，成像系统扫描，Image J软件分析，Western blot结果表示为目标蛋白条带灰度值/内参GAPDH灰度值。

1.3 统计学处理采用SPSS22.0软件进行统计学分析，数据采用±s表示。各组数据进行方差齐性检验，若方差齐则直接进行单因素方差分析，并用LSD进行两两比较；若方差不齐则先对数据进行变量转换，再进行单因素方差分析，并用LSD进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠一般状态空白组小鼠进食、饮水、活动度、毛色、体质量均正常；模型组小鼠进食、饮水减少，烦躁搔鼻，毛发蓬立且光泽度差，体质量减轻；地米组及蚓激酶组小鼠进食、饮水、毛色、搔鼻均较模型组改善，体质量较模型组增加。

2.2 4组小鼠肺组织病理学改变高倍镜下显示，空白组管腔平滑，未见明显炎症细胞浸润；模型组造模后，小鼠管腔及周围炎症细胞浸润明显，黏膜水肿增厚；地米组和蚓激酶组上述病理变化较模型组改善（图1）。

图1 4组小鼠肺组织病理变化（HE，×200）Fig.1 Pathological changes of lung tissue of mice in four groups（HE，×200）

2.3 4组小鼠BALF上清IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平与空白组比较，模型组小鼠IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.01），地米组、蚓激酶组IL-6、TGF-β水平差异有统计学意义（P<0.01），地米组、蚓激酶组IL-1β、TNF-α水平差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，地米组和蚓激酶组IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平显著降低（P<0.05，P<0.01），地米组与蚓激酶组差异无统计学意义（P>0.05，表2）。

表2 4组小鼠BALF上清IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平（±s，n=10，pg/ml）Tab.2 Levels of IL-6，TGF-β，IL-1βand TNF-αin BALF supernatant of mice in four groups（±s，n=10，pg/ml）

表2 4组小鼠BALF上清IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平（±s，n=10，pg/ml）Tab.2 Levels of IL-6，TGF-β，IL-1βand TNF-αin BALF supernatant of mice in four groups（±s，n=10，pg/ml）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.05，3）P<0.01.

Groups Blank Model Dexamethasone Lumbrokinase F P IL-6 9.17±1.02 19.00±2.721）14.07±1.861）3）15.72±1.591）2）23.288<0.001 TGF-β 28.15±6.56 54.97±7.591）39.35±7.361）3）44.75±5.171）2）13.760<0.001 IL-1β 13.92±2.30 22.97±4.791）15.97±4.262）16.04±4.622）4.616 0.016 TNF-α 241.74±45.38 659.12±129.861）347.99±58.453）351.86±75.413）23.125<0.001

2.4 4组小鼠肺组织T-bet、GATA-3 mRNA水平与空白组比较，模型组小鼠T-bet mRNA水平降低，GATA-3 mRNA水平升高（P<0.01），与模型组相比，地米组与蚓激酶组T-bet mRNA表达增加（P<0.01），GATA-3 mRNA表达减少（P<0.01），地米组与蚓激酶T-bet、GATA-3 mRNA水平差异无统计学意义（P>0.05，表3）。

表3 4组小鼠肺组织T-bet、GATA-3 mRNA水平比较（±s，n=10）Tab.3 Comparison of T-bet，GATA-3 mRNA levels in lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

表3 4组小鼠肺组织T-bet、GATA-3 mRNA水平比较（±s，n=10）Tab.3 Comparison of T-bet，GATA-3 mRNA levels in lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.01.

Groups Blank Model Dexamethasone Lumbrokinase F P T-bet 0.017 9±0.003 8 0.005 8±0.001 31）0.014 8±0.004 62）0.013 5±0.005 22）8.384 0.001 GATA-3 0.007 5±0.002 0 0.022 7±0.003 41）0.012 3±0.002 81）2）0.014 9±0.003 71）2）21.744<0.001

2.5 4组小鼠肺组织RORγt、Foxp3 mRNA水平

与空白组比较，模型组小鼠Foxp3 mRNA水平降低，RORγt mRNA水平升高（P<0.01），与模型组相比，地米组与蚓激酶组Foxp3 mRNA表达增加（P<0.01），RORγt mRNA表达减少（P<0.01），地米组与蚓激酶的RORγt、Foxp3 mRNA水平差异无统计学意义（P>0.05，表4）。

表4 4组小鼠肺组织RORγt、Foxp3 mRNA水平比较（±s，n=10）Tab.4 Comparison of lung tissues RORγt，Foxp3 mRNA levels of mice in four groups（±s，n=10）

表4 4组小鼠肺组织RORγt、Foxp3 mRNA水平比较（±s，n=10）Tab.4 Comparison of lung tissues RORγt，Foxp3 mRNA levels of mice in four groups（±s，n=10）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.01.

Groups Blank Model Dexamethasone Lumbrokinase F P RORγt 0.009 7±0.001 0 0.030 6±0.005 81）0.015 7±0.003 11）2）0.017 9±0.004 21）2）24.996<0.001 Foxp3 0.016 0±0.003 8 0.005 4±0.001 71）0.012 4±0.003 51）2）0.011 5±0.002 51）2）10.908<0.001

2.6 4组小鼠肺组织T-bet、GATA-3蛋白水平与空白组比较，模型组小鼠T-bet蛋白水平降低，GATA-3蛋白水平升高（P<0.01），与模型组相比，地米组与蚓激酶组T-bet蛋白表达增加（P<0.01），GATA-3蛋白表达减少（P<0.05），地米组与蚓激酶T-bet、GATA-3蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05，表5、图2）。

图2 4组小鼠肺组织T-bet、GATA-3蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoresis of T-bet and GATA-3 protein expressions in lung tissues of mice in four groups

表5 4组小鼠肺组织T-bet、GATA-3蛋白水平比较（±s，n=10）Tab.5 Comparison of T-bet and GATA-3 protein levels in lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

表5 4组小鼠肺组织T-bet、GATA-3蛋白水平比较（±s，n=10）Tab.5 Comparison of T-bet and GATA-3 protein levels in lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.05，3）P<0.01.

Groups Blank Model Dexamethasone Lumbrokinase F P T-bet 0.395 9±0.088 1 0.054 0±0.007 71）0.269 0±0.032 31）3）0.201 0±0.014 91）3）26.791<0.001 GATA-3 0.198 4±0.109 7 0.794 7±0.019 81）0.426 2±0.274 72）0.412 8±0.181 72）6.080 0.018

2.7 4组小鼠肺组织RORγt、Foxp3蛋白水平与空白组比较，模型组小鼠Foxp3蛋白水平降低，RORγt蛋白水平升高（P<0.01），与模型组相比，地米组与蚓激酶组Foxp3蛋白表达增加（P<0.01），RORγt蛋白表达减少（P<0.01），地米组与蚓激酶的RORγt、Foxp3蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05，表6、图3）。

图3 4组小鼠肺组织RORγt、Foxp3蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoresis of RORγt and Foxp3 protein expressions in lung tissues of mice in four groups

表6 4组小鼠肺组织RORγt，Foxp3蛋白水平比较（±s，n=10）Tab.6 Comparison of RORγt，Foxp3 protein levels of lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

表6 4组小鼠肺组织RORγt，Foxp3蛋白水平比较（±s，n=10）Tab.6 Comparison of RORγt，Foxp3 protein levels of lung tissues of mice in four groups（±s，n=10）

Note：Compared with blank group，1）P<0.01；compared with model group，2）P<0.01.

Groups Blank Model Dexamethasone Lumbrokinase F P RORγt 0.091 2±0.057 3 0.619 9±0.087 51）0.183 4±0.062 82）0.273 5±0.093 21）2）27.142<0.001 Foxp3 0.748 1±0.079 9 0.061 8±0.002 11）0.449 1±0.110 51）2）0.491 7±0.137 91）2）25.588<0.001

3 讨论

世界范围内哮喘患者超过3.39亿，仅2016年全球就有417 918人死于哮喘［6-7］。哮喘是儿童最常见的慢性疾病，遗传易感性与环境接触是哮喘发病的主要原因，气道慢性炎症是其最重要的发病机制之一。

哮喘发病过程中存在Th1/Th2和Th17/Treg失衡，TNF-α、IL-1β可促使免疫细胞向Th2/Th17偏移。促炎因子IL-6、TGF-β过分泌在哮喘中可诱导免疫相关转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3水平向Th2/Th17倾斜；而转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3分别作为Th1、Th2、Th17和Treg最具有特征性的分子标志物，调控这些免疫细胞分化。

TGF-β在Th17/Treg分化中不可或缺，IL-6则决定了二者分化比例，且介导Th1/Th2分化。IL-6是引起炎症反应和组织损伤的重要因子，可增加哮喘患病风险，并可作为评估哮喘的重要标志物［8］。IL-6对T细胞增殖与分化具有重要调控作用［9］。正常情况下，IL-6在IL-12作用下可刺激T-bet基因表达，从而激发Th1分化。IL-6可在IL-4作用下增加GATA-3基因表达，促进初始CD4+T细胞向Th2分化，且可诱导Th2和Th17优势分化，并通过巨噬细胞抑制Th1和Treg分化。过敏原刺激机体后，哮喘活动期和持续状态的气道中均发现不同程度IL-6水平升高［10-11］。IL-6基因敲除后，模型小鼠气道高反应性降低，气道炎症细胞募集与Th2、Th17细胞因子表达也 明 显 减 少［12］。TGF-β在IL-6缺 失 情 况 下增 加Foxp3 mRNA及蛋白表达，扩充Treg分化含量。而TGF-β在IL-6刺激下会诱导RORγt表达，增加Th17表达，而Th17也会分泌部分IL-6形成Th17分化的正反馈循环。

TNF-α、IL-1β同样作为前炎症细胞因子参与气道炎症反应，二者均可诱导ICAM-1、VCAM-1、E-selectin表达和趋化因子分泌，还可直接作用于平滑肌细胞和细胞间质放大炎症反应［13］。过敏原激活NLRP3后产生IL-1β，从而参与以Th2/Th17为优势的哮喘［14-15］。IL-1β可加强Th2型细胞因子IL-6、IL-13表达，也会诱导Treg向Th17分化加强炎症反应。炎症中TNF-α往往出现在IL-1β之后［16］。致敏阶段，TNF-α可通过促进CD11c+细胞分泌参与Th2/Th17介导的细胞炎症［17］。TNF-α可招募、激活嗜酸性粒细胞与中性粒细胞过表达，促进Th17向分化，通过刺激巨噬细胞活化增加细胞因子IL-6、IL-1β分泌。

药物干预是哮喘防治过程中的重要环节，从中药中提取的天然化合物对疾病研究及治疗得到了广泛认可。中药地龙具有清热定惊、通络平喘功效，治疗哮喘疗效确切，但具体机制尚不明确［18］。蚓激酶作为从地龙中提取的一组蛋白水解酶，具有良好的抗凝溶纤作用，临床被广泛用于心脑血管溶栓治疗。研究表明，蚓激酶还可通过发挥溶纤作用，改善大鼠肺纤维化症状，可能是地龙治疗哮喘的有效组分［19］。

本研究通过腹腔致敏与OVA雾化激发建立急性发作期哮喘小鼠模型，并在激发1 h后给予蚓激酶治疗，发现在哮喘急性期存在炎症因子IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平升 高，细胞转 录因子GATA-3、RORγt mRNA及蛋白表达增加，而T-bet、Foxp3 mRNA及蛋白水平显著降低。药物治疗后，哮喘小鼠肺组织炎症因子IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平降低，其中IL-1β与TNF-α降至正常水平，与空白组差异无统计学意义（P>0.05）。本研究还发现，蚓激酶可有效抑制Th2/Th17的特异性转录因子GATA-3、RORγt基因表达，减少其蛋白翻译；同时诱导Th1/Treg转录因子T-bet、Foxp3 mRNA及蛋白表达，因此，蚓激酶可降低IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-1β水平，调节转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3基因及蛋白表达。机体Th1/Th2和Th17/Treg分化离不开炎症因子和免疫细胞特异性转录因子参与，因此推测蚓激酶可能通过调节炎症因子IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水 平 及 转 录 因 子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3基因及蛋白表达改善哮喘小鼠Th1/Th2和Th17/Treg免疫失衡。本研究仅探讨了蚓激酶对免疫转录因子的影响，拟进一步探究其对细胞免疫失衡的作用机制。

总之，本研究表明，哮喘急性发作期存在炎症因子及免疫细胞特异性转录因子水平异常。蚓激酶可通过降低IL-6、TGF-β、IL-1β、TNF-α水平减少GATA-3、RORγt mRNA及蛋白转录和翻译，诱导T-bet、Foxp3 mRNA及蛋白表达，即通过降低相关前炎症因子水平调节免疫细胞转录因子表达，达到治疗哮喘的目的。