干扰MAFG-AS1靶向miR-335-3p对淋巴细胞白血病的影响

杨琪 王波涛 党惠兵（河南省南阳医学高等专科学校第一附属医院血液内科，南阳 473000）

淋巴细胞白血病是一种血液性的恶性肿瘤，按病程缓急分为急性和慢性，急性型常见于儿童，慢性型多见于中老年患者。分子靶向治疗是淋巴细胞白血病新型的治疗方式，研究其分子发病机制，可为临床新药研发提供参考［1-3］。研究表明血液恶性肿瘤中lncRNAs的异常表达参与其进展过程［4］。研究报道沉默lncRNA MAFG-AS1通过调控miR-3196抑制胰腺癌细胞增殖和迁移，促进胰腺癌细胞凋亡［5］。敲低MAFG-AS1可通过调节miR-150-5p抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移［6］。沉默MAFG-AS1抑制肺腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡［7］。然而MAFGAS1对淋巴细胞白血病的影响及机制尚不清楚。研究表明miRNA是肿瘤抑制因子和致癌基因，可作为治疗白血病的靶标［8］。研究报道miR-335-3p在急性淋巴细胞性白血病中低表达，与患者不良预后有关［9］。LncRNA CDKN2B-AS1通 过miR-335-3p/TRAF5轴促进小儿T细胞急性淋巴细胞白血病的肿瘤发生和化学耐药性［10］。本实验通过在线软件预测发现MAFG-AS1与miR-335-3p的结合位点。但MAFG-AS1是否通过靶向调控miR-335-3p影响淋巴细胞白血病还尚不清楚。因此，本实验旨在研究MAFG-AS1对淋巴细胞白血病的影响及机制是否与miR-335-3p表达有关。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料以2018年1月至2020年12月间河南省南阳医学高等专科学校第一附属医院25例急性白血病患者为研究对象，其中男16例，女9例，年龄12~68岁，平均（35.2±2.3）岁；并随机选取25例健康志愿者作为正常对照，抽取患者及健康对照的外周血标本，离心、分离血浆后置于-20℃冰箱保存待用。

1.1.2 主要试剂人T淋巴细胞白血病细胞HUT-78购自上海秋传生物科技有限公司；RPMI1640培养基购自上海玉博生物科技有限公司；Tripure分离试剂购自德国Roche公司；Trizol试剂购自上海瑞楚生物科技有限公司；荧光定量试剂盒购自上海子起生物科技有限公司；MTT试剂盒购自上海美轩生物科技有限公司；凋亡检测试剂盒购自上海机纯实业有限公司；双荧光素酶报告实验检测试剂盒购自上海英拜生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒购自南京恩晶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染与分组人T淋巴细胞白血病细胞HUT-78置于RPMI1640培养基在37℃的培养箱中培养，将MAFG-AS1抑制表达载体质粒及阴性对照，miR-335-3p模拟物或抑制剂及其对应的阴性对照转染至HUT-78，分别记为si-NC组、si-MAFGAS1、miR-NC组、miR-335-3p组、anti-miR-NC组、an⁃ti-miR-335-3p组；将MAFG-AS1抑制表达载体质粒与miR-335-3p抑制剂共转染至HUT-78，记为si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p组。

1.2.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测MAFGAS1和miR-335-3p的表达水平将分离后的血浆用Tripure分离试剂提取血浆总RNA；用Trizol试剂提取各组细胞的总RNA，将RNA反转录成cDNA（42℃反应1 h，95℃5 min，然后置于冰上），按照荧光定量试剂盒说明书进行PCR，扩增条件：94℃2 min；94℃30 s，58℃60 s，72℃30 s，共40个循环；后72℃延伸5 min；然后进行融解曲线；相对表达量用2-ΔΔCt法计算。MAFG-AS1正向引物：5'-GGGACG⁃GAGACAAATGACGG-3'，反向引物：5'-GCAGGCTCCCTGACACGTA-3'；GAPDH正向引物：5'-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3'，反向引物：5'-TTACTCCTT⁃GGAGGCCATGT-3'；miR-335-3p正向引物：5'-TCAAGAGCAATAACGAAAATGT-3'，反向引物：5'-TTTTTCATTATTGCTCCTGACC-3'；U6正向引物：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'。

1.2.3 MTT检测细胞活性将各组对数生长期细胞消化后接种于96孔板，每组设3个复孔，分别培养至24 h、48 h、72 h时，每孔加入20μl的MTT溶液，反应4 h后加入150μl DMSO，振荡反应10 min，用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度（OD）值。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡收集各组细胞，PBS洗2遍后调细胞浓度2×106个/ml，用结合缓冲液重悬，取490μl细胞加入5μl FITC-Annexin V及5μl PI，混匀温育10 min，上机分析，同时以不加Annexin V-FITC及PI的细胞作为阴性对照。

1.2.5 双荧光素酶报告实验构建MAFG-AS1的野生型和突变型荧光素酶载体，待细胞密度达到70%时，将其分别与miR-NC和miR-335-3p共转染至HUT-78胞中，转染48 h后按照试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.2.6 Western blot法检测蛋白表达提取各组细胞的总蛋白，取30μl蛋白样品进行SDS-PAGE，通过湿转法将蛋白转至PVDF膜，加入封闭液室温反应2 h；洗膜后加入稀释好的一抗4℃过夜，倒掉一抗并洗膜后再加入稀释好的二抗，室温培养2 h，加入显色液显影，成像后用Image J软件分析蛋白条带的灰度水平，计算蛋白表达水平。

1.3 统计学分析采用SPSS20.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAFG-AS1、miR-335-3p在白血病患者中的表达与正常人血浆相比，白血病患者血浆中MAFGAS1表达水平升高，miR-335-3p表达水平降低（P<0.05，表1）。

表1 检测白血病患者中MAFG-AS1、miR-335-3p表达（±s，n=25）Tab.1 Detection of MAFG-AS1 and miR-335-3p expres⁃sion in leukemia patients（±s，n=25）

表1 检测白血病患者中MAFG-AS1、miR-335-3p表达（±s，n=25）Tab.1 Detection of MAFG-AS1 and miR-335-3p expres⁃sion in leukemia patients（±s，n=25）

Note：Compared with plasma of normal human group，1）P<0.05.

Groups Plasma of normal human Plasma of leukemia patients t P MAFG-AS1 1.02±0.13 5.33±0.271）71.913 0.000 miR-335-3p 0.99±0.11 0.16±0.031）36.398 0.000

2.2 各处理组中MAFG-AS1和miR-335-3p表达情况的检测与si-NC组相比，si-MAFG-AS1组MAFGAS1表达水平降低，miR-335-3p表达水平升高（P<0.05）；与miR-NC组相比，miR-335-3p组miR-335-3p表达水平升高（P<0.05）；与anti-miR-NC组相比，an⁃ti-miR-335-3p组miR-335-3p表 达 水 平 降 低（P<0.05）；与si-MAFG-AS1组相比，si-MAFG-AS1+antimiR-335-3p组miR-335-3p表达水平降低（P<0.05，图1）。

图1 MAFG-AS1和miR-335-3p的表达Fig.1 Expression of MAFG-AS1 and miR-335-3p

2.3 各处理组中细胞活性的检测与si-NC组相比，si-MAFG-AS1组细胞活性降低（P<0.05）；与miR-NC组相比，miR-335-3p组细胞活性降低（P<0.05）；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-335-3p组细胞活性升高（P<0.05）；与si-MAFG-AS1组相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p组细胞活性升高（P<0.05，图2）。

图2 各处理组细胞活性的检测Fig.2 Detection of cell viability in each treatment group

2.4 各处理组中凋亡率的检测与si-NC组相比，si-MAFG-AS1组细胞凋亡率升高（P<0.05）；与miRNC组相比，miR-335-3p组细胞凋亡率升高（P<0.05）；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-335-3p组细胞凋亡率降低（P<0.05）；与si-MAFG-AS1组相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p组细胞凋亡率降低（P<0.05，图3、表2）。

表2 流式细胞仪检测各处理组细胞凋亡率（±s，n=3）Tab.2 Flow cytometry detection of apoptosis rate of each treatment group（±s，n=3）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05；compared with miR-NC group，2）P<0.05；compared with anti-miR-NC group，3）P<0.05；compared with si-MAFG-AS1 group，4）P<0.05.

Groups si-NC si-MAFG-AS1 miR-NC miR-335-3p anti-miR-NC anti-miR-335-3p si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p F P Apoptosis rate（%）8.63±0.22 21.44±0.831）8.54±0.38 24.70±0.992）8.75±0.37 3.60±0.383）13.57±0.614）491.787 0.000

图3 细胞凋亡率的检测Fig.3 Detection of cell apoptosis rate

2.5 MAFG-AS1靶向miR-335-3p关系的验证DI⁃ANA Tools预测显示MAFG-AS1和miR-335-3p有互补序列（图4）。Wt-MAFG-AS1与miR-335-3p共转染的细胞荧光素酶活性降低，而Mut-MAFG-AS1与miR-335-3p共转染的细胞荧光素酶活性无显著变化（表3）。

图4 MAFG-AS1和miR-335-3p的互补序列Fig.4 Complementary sequence of MAFG-AS1 and miR-335-3p

表3 荧光素酶活性的检测（±s，n=3）Tab.3 Detection of luciferase activity（±s，n=3）

表3 荧光素酶活性的检测（±s，n=3）Tab.3 Detection of luciferase activity（±s，n=3）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-335-3p t P Wt-MAFG-AS1 0.96±0.09 0.15±0.011）15.493 0.000 Mut-MAFG-AS1 0.93±0.08 1.01±0.06 1.386 0.238

2.6 各处理组中凋亡蛋白表达的检测与si-NC组相比，si-MAFG-AS1组Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低（P<0.05）；与miR-NC组相比，miR-335-3p组Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低（P<0.05）；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-335-3p组Bax表达水平降低，Bcl-2表达水平升高（P<0.05）；与si-MAFG-AS1组相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p组Bax表达水平降低，Bcl-2表达水平升高（P<0.05，图5、表4）。

图5 Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达Fig.5 Western blot detection of Bax and Bcl-2 protein expression

表4 Western blot检测各处理组细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达（±s，n=3）Tab.4 Western blot detection of Bax and Bcl-2 protein expressions in cells of each treatment group（±s，n=3）

表4 Western blot检测各处理组细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达（±s，n=3）Tab.4 Western blot detection of Bax and Bcl-2 protein expressions in cells of each treatment group（±s，n=3）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05；compared with miR-NC group，2）P<0.05；compared with anti-miR-NC group，3）P<0.05；compared with si-MAFG-AS1 group，4）P<0.05.

Groups si-NC si-MAFG-AS1 miR-NC miR-335-3p anti-miR-NC anti-miR-335-3p si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p F P Bax 0.23±0.02 0.68±0.051）0.23±0.02 0.80±0.062）0.24±0.01 0.07±0.013）0.34±0.034）187.250 0.000 Bcl-2 0.82±0.07 0.26±0.021）0.83±0.08 0.14±0.012）0.82±0.08 1.35±0.093）0.71±0.054）125.507 0.000

3 讨论

非编码RNA在淋巴细胞白血病的发生和发展中起主要作用，作为潜在的生物标志物和治疗靶标用于淋巴细胞白血病的靶向治疗［11-12］。lncRNA作为非编码RNA的一种，参与调控淋巴细胞白血病的进展，如lncRNA-H19通过靶向miR-29a-3p促进急性髓性白血病细胞增殖，但抑制细胞凋亡［13］。lnc-RNA ANRIL可促进成人T细胞白血病细胞的增殖［14］。MAFG-AS1作为lncRNA的一种，已有研究报道MAFG-AS1可调控结直肠癌、卵巢癌及宫颈癌细胞的增殖和凋亡［15-17］。而MAFG-AS1对淋巴细胞白血病的影响尚不清楚。本实验结果显示，白血病患者血浆中MAFG-AS1表达水平升高；干扰MAFGAS1后，淋巴细胞白血病细胞的活性降低，凋亡率升高，Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低，表明干扰MAFG-AS1可抑制淋巴细胞白血病细胞的增殖，促进细胞凋亡。

研究报道miR-335-3p靶向COPB2促进肺腺癌NCI-H1975细胞的凋亡，抑制细胞迁移和增殖［18］。CASC9可以通过miR-335-3p/S100A14轴促进非小细胞肺癌进展［19］。本实验结果显示，白血病患者血浆中miR-335-3p表达水平降低，过表达miR-335-3p可降低细胞活性，提高细胞凋亡率，表明过表达miR-335-3p可抑制淋巴细胞白血病细胞的增殖，促进细胞凋亡。而抑制miR-335-3p表达与过表达miR-335-3p的作用相反。且本实验还发现MAFGAS1靶向负调控miR-335-3p，抑制miR-335-3p表达减弱了干扰MAFG-AS1对淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响。

综上所述，干扰MAFG-AS1通过靶向上调miR-335-3p抑制淋巴细胞白血病细胞的增殖，促进细胞凋亡。