微生物源乳酸链球菌素(Nisin)及在食品中应用研究进展

姚文俊，杨勇，刘希，童星*

(1.广东海天创新技术有限公司,广东 佛山 528000;2.佛山市海天(高明)调味食品有限公司,广东 佛山 528511)

食品在生产及使用储存过程中,面临着微生物污染导致的食品腐败、货架期缩短等问题,而传统的化学防腐剂已难以满足人们追求绿色、健康、环保的食品消费观念。因此,天然抑菌剂成为各个食品公司追求的热点,越来越多的食品都向着天然健康、不含化学防腐剂的方向发展。乳酸链球菌素(Nisin)是一种天然、高效、无毒的抑菌物质,在食品中得到广泛的应用。本研究结合国内外的研究进展,对Nisin的结构、生物合成及其在食品中的防腐、保鲜、提质、可降解包材等作用方面的应用研究进展进行综合论述,为后续研究提供参考。

1 乳酸链球菌素(Nisin)概述

1.1 乳酸链球菌素(Nisin)的结构

细菌素是由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生的蛋白质化合物。1928年研究人员首次发现了乳酸菌产生的细菌素。随后该细菌素于1971年被鉴定命名为乳酸链球菌素(Nisin)。

乳酸链球菌素(Nisin)属于Ⅰ型羊毛硫菌素,由5个硫醚环状结构和34个氨基酸构成,分子量约为3 500 Da,结构中主要包含多个特征氨基酸,如羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸(位置5 和33)、脱氢丁氨酸(位置2)、氨基丁酸。赖氨酸和异亮氨酸分别位于C端和N 端[1]。C端和N 端为两个特征结构域,C端由D和E 2个硫醚环组成,D端由A、B、C 3个硫醚环组成,C端和D端之间由一条柔韧的铰链区衔接,构成其独特的结构特征,该结构及氨基酸分布导致Nisin具有高等电点(pH 9)及在宽范围的pH 条件下都带正电荷,pH 越高,溶解性越低,其抑菌活性越低[2]。

天然的乳酸链球菌素含有多个异构体,主要为Nisin A,具体结构见图1。

图1 Nisin A结构Fig.1 Structure of Nisin A

不同的异构体之间存在的某一位或者某几位的氨基酸残基不同,导致其部分功能活性也不同。如Nisin A与Nisin Z之间的不同在于第27 位氨基酸残基,Nisin A 为组氨酸残基,而Nisin Z的27位为天冬氨酸残基[3]。但是Nisin Z相比于Nisin A 具有更好的扩散性及更高的溶解性[4]。Laridi等[5]研究发现针对抑制梭状芽孢杆菌,Nisin A 的MIC(最小抑菌浓度)为0.8 μg/mL,远低于Nisin Z 的MIC。Nisin Q 由于仅存在一个甲硫氨酸残基,相比于Nisin A,具有更高的抗氧化活性[6]。Nisin的各个异构体之间的氨基酸序列区别[7]见表1。

表1 天然细菌素Nisin的异构体及氨基酸序列Table 1 Isomers and amino acid sequences of the natural bacteriocin Nisin

1.2 乳酸链球菌素(Nisin)的抑菌机理

Nisin表现出对革兰氏阳性菌广泛的抑制作用,在较低的纳摩尔浓度范围内对许多革兰氏阳性菌包括腐败和食源性病原体都具有有效抑制及杀死细胞的作用,如葡萄球菌、杆菌、肉毒梭菌、单增李斯特菌和多种抗药性细菌。

乳酸链球菌素发挥其抗菌作用,主要有两个步骤：第一步,Nisin属于阳离子肽[8],通过疏水或静电相互作用作用于细胞壁上的磷壁酸和脂磷壁酸、酸性多糖或磷脂等阴离子成分。一旦接触到作用细胞的细胞膜,便开始进行与细胞的相互作用,杀灭细菌[9]。第二步,通过细胞膜孔的形成,Nisin的N末端区域对细胞壁的基本前体物质脂质Ⅱ具有高度选择性[10],组装成一个总计由4个Nisin分子和8个脂质Ⅱ分子构成强有力的“打孔器”,在目标细菌的细胞膜上形成结构非常稳定的孔洞,从而抑制细胞壁的合成。这种结合在细胞膜中形成孔隙,导致离子和细胞质溶液快速流出,受损的细胞不能像重要的大分子一样产生能量,最终导致细胞死亡,除了作用于脂质Ⅱ的介导方式外,还可使细胞壁裂解而导致细胞死亡[11],作用机制图见图2[12]。值得注意的是,脂质Ⅱ也是糖肽抗生素万古霉素的靶点。但是,由于Nisin在不同于万古霉素的部位结合脂质Ⅱ,因此它保留了对万古霉素耐药的革兰氏阳性病原菌的活性[13]。

图2 Nisin抑菌作用机制图Fig.2 Antibacterial action mechanism of Nisin

2 乳酸链球菌素(Nisin)的生物合成

2.1 乳酸链球菌素(Nisin)的生物合成基因簇

近年来,天然产物肽的生物合成无论是基因编码的还是非核糖体起源的,均受到广泛关注。Nisin的生物合成基因簇大小为15 kb左右。

一个成熟的Nisin 分子的合成主要包括编码Nisin前体的结构基因NisinA,对Nisin前体进行后修饰的蛋白基因NisinB和NisinC,前体修饰后的分泌基因NisinT,自身的免疫基因NisinIFEG,酶解释放基因NisinP,双组分调节系统基因NisinKR。以最具典型的Nisin A的生物合成基因簇为例,其合成基因簇见图3。

图3 Nisin A生物合成基因簇的结构Fig.3 Structure of Nisin A biosynthetic gene cluster

2.2 乳酸链球菌素(Nisin)的生物合成顺序

第一步,诱导信号通过双组分信号通路激活负责表达Nisin操纵子的启动子,细胞中的核糖体负责合成乳酸链球菌素的前体肽Nisin A,Nisin A 没有活性,结构包括N 端先导肽以及C-末端前肽[14]。

第二步,前体修饰蛋白基因NisinB催化1个丝氨酸和4个苏氨酸残基脱水,生成相应的脱氢丙氨酸Dha和Z-脱氢氨基丁酸残基Dhb[15]。

第三步,前体修饰蛋白基因NisinC催化分子内Michael加成反应[16],将半胱氨酸的巯基和脱氢丙氨酸或脱氢氨基丁酸残基的双键进行加成,生成羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸的硫醚交联产物。由于羊毛硫肽含有大量的丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸残基,在此过程中底物Ser/Thr残基的α-碳在立体化学上被转变为D构型[17]。因此终产物是多环结构,构成5个环硫醚,此过程显示出显著的结构多样性。

第四步,含有前导肽的Nisin随后通过专门的转运子分泌基因NisinT运输,然后在N端前导序列被特殊的胞外丝氨酸蛋白酶NisinP水解,此时的Nisin才具有生物活性被分泌释放。

乳酸链球菌素在生物合成过程中,由于其具有抗菌性质,在合成过程中通过不同的系统组成的脂蛋白NisinI和ABC转运子NisinFEG构成自身免疫系统[18],在合成与免疫之间通过组氨酸激酶NisinK和转录反应调节因子NisinR组成的双组分系统调节以维持在生产和免疫之间的适当平衡[19]。具体合成顺序见图4[20]。

图4 Nisin A的生物合成过程Fig.4 Biosynthesis process of Nisin A

3 高产乳酸链球菌素(Nisin)的选育方法

3.1 诱变育种

目前诱变选育的方法主要有化学诱变和物理诱变,化学诱变采用亚硝酸盐、硫酸二乙酯等诱变剂,该方法诱变效果明显,如徐文生等[21]采用亚硝酸协调紫外照射方法处理乳酸链球菌,产量较处理之前提高了1.72倍。但是本身的化学诱变剂含毒性高,受到了应用限制。物理诱变如紫外照射、等离子注入诱变等,其中等离子诱变因无毒、快速、高效等特点受到科研人员追捧。张拴力等[22]采用等离子诱变选育乳酸链球菌,Nisin产量提高近6倍。

3.2 基因修饰

诱变选育虽然简单、快速,但是诱变选育结果为随机性,工作量大。采用基因工程对菌株进行针对性改造,成为提升Nisin产量的有效方法。基因修饰主要有两种方向：一种是对环境相关基因修饰,修饰某个与环境相关的基因,通过增强Nisin生产菌株在发酵条件中的耐受性和抗逆性来增加其产量。Hao等[23]针对Nisin生产菌株的D-天冬氨酸酰胺化相关基因修饰使其过表达,提高菌株在酸性条件下的存活能力,继而提升菌株的Nisin产量。另一种是对生产Nisin表达相关基因修饰,增强其Nisin生产的代谢途径能力。黄硕[24]采用电场强度10 kV/cm、频率1500 Hz、电击时间5 s进行电转化,将Nisin的前体基因NisinA克隆构建质粒,构建的工程菌Nisin 产量较之前提高至25%。

4 乳酸链球菌素(Nisin)在食品中的应用进展

食品因富含各种蛋白、氨基酸、糖等营养物质,在使用过程中和储藏过程中很容易遭受微生物污染。目前在食品生产中,常采用化学防腐剂来保持食品的安全品质。随着生活水平的日益提高,天然防腐剂Nisin 在食品中的应用越来越广。有直接添加Nisin用于抑菌,也有在产品生产过程中采用相应菌株进行直接发酵产Nisin。此外,Nisin应用于食品中已不仅仅是作为防腐剂使用,还存在多种功能,以下归纳了Nisin在食品中的功能应用进展。

4.1 产品防腐抑菌

Nisin在成品中添加能有效地提升产品的防腐能力。目前Nisin用于防腐抑菌,随着应用范围变广,使用的形式也在向着更稳定、抑菌能力更强、更适应产品体系的方向发展,以下归纳了Nisin作为天然的防腐剂应用于食品中的进展。

4.1.1 单独添加

Nisin本身具有抑菌范围广等特点,单独添加是最经济和简单的添加方式。如刘月琴等[25]研究表明，在啤酒生产过程中加入Nisin可有效抑制腐败菌生长。张二康等[26]将Nisin添加于发酵辣椒中,在长期发酵和保藏期间,可以控制产品持续发酵不受微生物污染。此外,单独添加还可以辅助物理加工手段,提升Nisin的抗菌性能,Costello等[27]在加工过程中以超声辅助强化了Nisin对李斯特菌和大肠杆菌的杀灭能力。此方式针对某类微生物的抑菌作用,但单独使用抑菌范围较小,在食品应用中存在诸多限制。

4.1.2 混合复配

随着Nisin的进一步应用,Nisin的局限性也随之放大,Nisin对阴性菌有较强的抑制作用,但是针对真菌抑菌能力较差。因此,越来越多的企业寻求与其他抑菌物质复配使用,进一步扩大抑菌范围和抑菌能力。与常规添加剂复配:迟明梅等[28]采用Nisin与脱氢乙酸钠等复配应用于卤豆干中,能有效抑制卤豆干菌落总数的增殖；与其他微生物源抑菌剂复配:李惠等[29]采用Nisin和纳他霉素复配,能有效抑制番茄酱中的微生物,延长保质期；与天然植物复配:鞠健等[30]将Nisin与茶多酚、迷迭香复配,延长了冷藏鲈鱼的货架期。混合复配拓宽了Nisin的应用范围。

4.1.3 复配改性

随着技术的发展和生活水平的提升,食品的品质越来越被看重,针对Nisin的应用要求也越来越高,除了抑菌的能力,在产品的保藏期间,对抑菌的稳定性要求越来越严格,相比于简单物理混合复配,采用物理手段或者化学反应等进行复配结合,提升Nisin 在产品中抑菌的稳定性,摆脱产品的环境因素、Nisin 自身易被降解等因素导致的抑菌稳定性差等困扰。郑晓杰等[31]采用美拉德反应制备壳寡糖-Nisin共价复合物,对比简单的混合,壳寡糖-Nisin共价复合物具有抑菌能力更强、稳定性更好的优势。张舒雯等[32]通过皮克林乳液将Nisin与肉桂醛进行包埋制备,抑菌效果不仅高于简单的复合,而且提升了产品保质期期间防腐的稳定性。Qian等[33]采用果胶和壳聚糖复合包埋Nisin制备微胶囊,能极大地提升Nisin在加工过程中被降解的风险,提升了抑菌的稳定性及抗逆性。Luo等[34]采用大豆可溶性多糖包裹Nisin和姜黄素制备成纳米粒子,提升了Nisin的溶解度、分散性和稳定性。

4.2 改善食品品质

Nisin不仅有防腐抑菌的功能,而且可以改善产品的品质。将产Nisin的乳酸链球菌应用到白酒发酵中,可抑制有害微生物,白酒的口感也得到提升[35]。孙文佳[36]添加0.15 g/kg的Nisin于豆瓣酱中,在有效提升防腐能力的同时,还能降低食盐的使用。李继胜在酱醪发酵时添加0.4%的Nisin发酵液,酱醪氨基酸态氮含量提升24.7%。李增利等[37]研究发现在酱油处理过程中添加Nisin,可以减少酱油的灭菌时间,使酱油中的营养成分有效保持,且能提升酱油的色泽、风味。焦宇知[38]在泡菜发酵过程中添加Nisin,在抑菌的同时,还可以改善泡菜的氨基酸,更符合营养配比,同时降低了泡菜中的亚硝酸盐含量。

4.3 生鲜保鲜

如何提升生鲜保质期和降低存储期间营养流失,是企业一直探索的问题。随着对Nisin的研究深入,Nisin在生鲜食品中的应用保鲜也越来越广。李晨等[39]采用明胶和壳聚糖为基料与Nisin等制备复合保鲜剂涂抹于鲈鱼鱼糜,能有效减缓鱼糜蒸煮过程中的营养损失,同时使Nisin更加稳定,降低微生物污染。Cen等[40]研究发现,Nisin结合壳聚糖及海藻酸钠处理南美白对虾,可以有效延长其冷藏保质期,与未处理的南美白对虾相比,感官评分更高。张晓虎等[41]用Nisin与黄芩苷制备保鲜液,可有效延长香蕉的储存期、维持水分不变、缓解褐变、增强硬度等。

4.4 抑菌可降解包装材料

随着Nisin的应用扩展,Nisin已不再局限于应用于产品中。Nisin由于具有抑菌性能及可以生物降解的优势,目前研究人员已经开始大量研究Nisin与其他可降解物质结合,制备具有抑菌功能的可降解生物基材料,用于食品包装。Leelaphiwat等[42]研究发现,Nisin与乙二胺四乙酸(EDTA)混合物和热塑性淀粉混合物(PBAT/TPS)通过吹塑复合而成的一种可生物降解薄膜应用于猪肉包装中,可保持猪肉的品质,延长储存期。Jiang等[43]采用Nisin制成纳米粒子,与聚乙烯醇和聚丙烯酸钠复合制成可降解的纳米纤维膜,能有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。Yang等[44]通过将Nisin与甘蔗渣纳米纤维素进行复合制备纳米纤维膜,将其应用于即食火腿的包装,可有效抑制李斯特单胞菌的污染。Wang等[45]将Nisin与紫苏精油复配,与N-琥珀壳聚糖制备抗菌薄膜,具有生物降解等环保性能,还提升了常规保鲜薄膜的机械性能、水蒸气阻隔性能及光学性能,将其应用于草莓包装,延缓了草莓的腐烂。

5 展望

食品的安全性如保质期安全、食品添加剂安全、食品包装环保等一直是社会关注的焦点,也是一直存在的亟待解决的问题。如何在大众追求绿色健康环保、无化学防腐剂的食品潮流下,提高食品的保质期和品质,是食品企业需要长期探索的问题。微生物源抑菌剂Nisin因具有无毒、绿色的特点,一直受到食品企业的青睐,但Nisin也因产量低、提取繁琐等问题导致成本较化学防腐剂高,一直未大范围使用,此外,Nisin 抑菌范围有限,也需搭配其他抑菌剂复配使用,发挥其最大作用。本文从分子水平阐述了Nisin的结构及生物合成途径,综述了Nisin在食品中抑菌、保鲜、提质、生物降解包装等作用的研究进展,旨在为今后提高Nisin 的开发价值及挖掘更多的微生物源抑菌剂提供理论参考。只有更多的微生物源抑菌剂面世,才能进一步推动绿色健康食品的发展。