高危型人乳头瘤病毒感染宫颈癌组织中N-myc下游调节基因1蛋白表达及其临床意义分析

张云珠，王宇华，王梅，张爱，叶文凤，陶萍萍

上海市浦东新区人民医院妇产科，上海 201299

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤疾病，严重威胁女性健康及生命安全。已有研究发现，单一高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宫颈癌患者的主要感染类型，且与病理组织类型和分化程度有关[1]。不少病情相似的宫颈癌患者根治术后生存结局有较大的差异，推测存在某些影响宫颈癌患者预后的重要因素。N-myc下游调节基因1（N-myc downstream regulated 1，NDRG1）是近年发现的一种新基因，定位于人染色体9q24.3，广泛分布于人体多种组织中，已经被发现在卵巢癌[2]、子宫内膜癌[3]等女性生殖系统肿瘤组织中存在异常表达并参与疾病的发生发展过程，推测其对宫颈癌的发生发展及预后等方面也存在一定影响，但目前相关研究涉及较少。本研究探讨高危型HPV感染宫颈癌组织中NDRG1蛋白表达及其与患者临床特征和预后的关系，为预后预测、治疗方案优化等提供更多可靠的参考指标，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月至2017年1月在上海市浦东新区人民医院接受治疗的高危型HPV感染宫颈癌患者的病历资料。纳入标准：①术中病理明确为原发性宫颈癌；②符合手术指征，完成术后放化疗；③全程配合治疗及随访；④临床资料完整。排除标准：①合并其他原发恶性肿瘤；②合并基础性严重心肝肾功能不全、自身免疫性疾病、血液系统疾病；③既往心脑血管病史、精神疾病；④妊娠期或者哺乳期女性；⑤临床标本污染。根据纳入、排除标准，共纳入50例高危型HPV感染宫颈癌患者作为宫颈癌组。另选取同期在上海市浦东新区人民医院进行治疗的50例高危型HPV感染宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者作为CIN组，所有CIN患者均行宫颈锥切术并经病理证实且临床资料完整。两组患者的年龄、病程、体重指数、孕次及产次比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

表1 两组患者的临床特征（±s）

表1 两组患者的临床特征（±s）

临床特征年龄（岁）病程（年）体重指数（kg/m2）孕次产次宫颈癌组（n=50）47.82±7.17 5.43±1.62 21.56±1.68 1.65±0.35 1.42±0.28 CIN组（n=50）46.21±5.64 5.68±1.43 21.98±1.95 1.59±0.39 1.34±0.27

1.2 免疫组化法检测NDRG1蛋白表达情况

宫颈癌组织、CIN组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，热抗原修复，3%过氧化氢孵育10 min，然后加入鼠抗人NDRG1单克隆抗体（1∶400稀释），4℃恒温过夜，滴加过氧化物酶标记二抗（1∶2000稀释），孵育60 min后加入二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂显色，苏木素复染1 min后梯度乙醇分化30 s，氨水返蓝1 min，乙醇脱水，中性树胶封片。

每个切片随机选取5个高倍视野观察NDRG1阳性染色情况，NDRG1定位于细胞质与细胞核，呈棕黄色、淡黄色、棕褐色染色，依据染色程度、阳性细胞百分比评估阳性情况。染色程度：0分（无着色）、1分（淡黄色）、2分（棕黄色）、3分（棕褐色）；阳性细胞百分比：0分（无阳性细胞）、1分（阳性细胞百分比≤10%）、2分（10%＜阳性细胞百分比≤50%）、3分（50%＜阳性细胞百分比≤80%）、4分（阳性细胞百分比＞80%）。染色程度评分×阳性细胞百分比评分＞4分为阳性。

1.3 术后随访及预后评估

术后对所有宫颈癌患者进行长期随访，随访形式包括门诊复诊及电话，终点事件为患者全因死亡。以术后第1天作为随访起点，2021年1月1日或者该日期前患者终点事件出现作为随访终点。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存情况比较采用Log-rank检验；多因素分析采用Cox回归分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NDRG1蛋白表达情况的比较

宫颈癌组患者宫颈癌组织中NDRG1蛋白阳性表达率为70.0%（35/50），高于CIN组患者CIN组织中的48.0%（24/50），差异有统计学意义（χ2=5.002，P=0.025）。

2.2 不同NDRG1蛋白表达情况高危型HPV感染宫颈癌患者临床特征的比较

NDRG1蛋白阳性表达与NDRG1蛋白阴性表达高危型HPV感染宫颈癌患者年龄、肿瘤最大直径、组织学类型、分化程度、肌层浸润深度比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；NDRG1蛋白阳性表达与NDRG1蛋白阴性表达高危型HPV感染宫颈癌患者国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期、宫旁侵犯情况、淋巴结转移情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

2.3 不同NDRG1蛋白表达情况高危型HPV感染宫颈癌患者预后的比较

Kaplan-Meier生存曲线显示，NDRG1蛋白阴性表达高危型HPV感染宫颈癌患者生存情况优于NDRG1蛋白阳性表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。（图1）

图1 NDRG1蛋白阴性表达（n =15）与NDRG1蛋白阳性表达（n =35）高危型HPV感染宫颈癌患者的生存曲线

2.4 高危型HPV感染宫颈癌患者预后影响因素分析

将高危型HPV感染宫颈癌患者预后作为因变量（生存=0，死亡=1），将单因素分析中差异有统计学意义的指标（包括FIGO分期、宫旁侵犯、淋巴结转移、NDRG1蛋白表达）纳入多因素Cox回归分析，结果显示，FIGO分期为Ⅲ期、合并宫旁侵犯、合并淋巴结转移、NDRG1蛋白阳性表达均是高危型HPV感染宫颈癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。（表 2）

表2 高危型HPV感染宫颈癌患者预后影响因素的单因素及多因素分析

表2 不同NDRG1蛋白表达情况高危型HPV感染宫颈癌患者临床特征的比较

3 讨论

NDRG1与细胞增殖及分化、肿瘤发生均密切相关，且已在多种常见恶性肿瘤组织中发现存在NDRG1表达改变，提出NDRG1可能成为肿瘤治疗的新靶点[4-6]。最新动物研究发现，放疗、化疗及放化疗可引起小鼠宫颈癌组织中NDRG1表达量降低[7]，推测治疗前宫颈癌组织中NDRG1表达情况可能与病情等相关。本研究发现高危型HPV感染宫颈癌患者的宫颈癌组织中NDRG1蛋白阳性表达率上升，这与该分子在结直肠癌[8]、胆囊癌[9]等恶性肿瘤组织中的表达变化趋势吻合。

后续在高危型HPV感染宫颈癌组织中NDRG1蛋白表达情况与临床特征分析中发现，NDRG1蛋白阳性表达与NDRG1蛋白阴性表达高危型HPV感染宫颈癌患者FIGO分期、宫旁侵犯情况、淋巴结转移情况比较，差异均有统计学意义。FIGO分期、宫旁侵犯、淋巴结转移均是临床公认的影响恶性肿瘤病情及进展的临床特征，上述结果提示高危型HPV感染宫颈癌患者NDRG1蛋白表达情况可能在提示疾病严重程度方面具有重要意义。分化程度在恶性肿瘤病情中的影响也较为重要，但是本研究中NDRG1蛋白阳性表达与NDRG1蛋白阴性表达高危型HPV感染宫颈癌患者分化程度比较，差异无统计学意义，可能与纳入的高危型HPV感染宫颈癌患者病例数较少、两组间低分化例数差异未得到有效呈现有关，后续可扩大样本量进一步明确其影响。

高危型HPV感染宫颈癌患者的术后5年生存率仍不理想[10-12]，鉴于NDRG1蛋白表达情况与临床特征的关系，本研究分析不同NDRG1蛋白表达情况的高危型HPV感染宫颈癌患者术后生存情况的差异，结果发现，NDRG1蛋白阴性表达患者的生存情况优于NDRG1蛋白阳性表达患者，提示NDRG1蛋白阳性表达可能导致高危型HPV感染宫颈癌患者术后预后不佳。进一步多因素Cox回归分析也证实，NDRG1蛋白阳性表达是高危型HPV感染宫颈癌患者预后的独立危险因素。NDRG1蛋白阳性表达通过何种途径左右高危型HPV感染宫颈癌患者的术后生存结局尚不明确。在其他疾病中对NDRG1的作用途径研究有部分开展，如林简等[13]的研究指出，NDRG1通过调控磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路对皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡产生影响。李婷和李赟[14]发现，过表达NDRG1通过调控WNT/β-catenin信号通路促进滋养层细胞上皮-间充质转化。在高危型HPV感染宫颈癌患者中，NDRG1高表达可能也通过相似途径影响肿瘤细胞的恶性行为并最终对患者术后生存结局产生影响，关于具体途径的探索有待后续基础及临床研究深入开展明确。

综上所述，高危型HPV感染宫颈癌患者宫颈癌组织中NDRG1蛋白阳性表达率较高，与患者临床特征、预后等均密切相关，可能是高危型HPV感染宫颈癌发病、进展的重要分子之一，也对后续同类疾病的不良预后预测及治疗方案制订等提供参考意见，具有一定临床价值。