基于网络药理学和分子对接探讨黄芪-人参药对治疗胃癌的作用机制△

黄洪，张燕，张志娜，张宁，吴志斌，王定雪，王镜辉，叶涛

1贵州中医药大学第一临床医学院，贵阳 550002

贵州中医药大学第一附属医院2药剂科，3肿瘤科，4康复科，贵阳 550001

胃癌发病率居中国恶性肿瘤第三位，2020年新发病例数、病死例数均位居全球第一[1]。胃癌发病因素多且复杂，患者多伴有慢性胃病史、家族遗传史，主要由生活压力过大、饮食不规律等生活因素造成，患者大多表现为体重急剧下降，上腹疼痛，伴有乏力、便血等症状[2-3]。中医胃癌属于胃脘痛、噎膈、积聚等，临床常用黄芪-人参药对治疗肿瘤后期正气亏损、气阴两伤、脾胃受损，可达到补气养血扶正的目的，可改善患者的生活质量。研究显示及对国医大师刘尚义教授临床用药规律总结发现，黄芪-人参药对对原发性胃癌或胃癌放化疗后症状改善及身体机能恢复方面疗效显著，但具体的机理尚不清楚，有待进一步研究[4]。近年来，中药复方网络药理学和分子对接技术多用于探讨中药的有效化学成分、通过靶点治疗疾病的作用机制、构建蛋白质-配体之间相互作用的分子对接，可将中药方剂治疗疾病的机理可视化。因此，本研究运用中药复方网络药理学和分子对接技术，构建“药物-有效成分-靶点-疾病”网络，探讨黄芪-人参药对中的有效活性成分、靶点及其治疗胃癌的作用机制，为临床医师临证用药提供一定参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 黄芪-人参药对有效活性成分和靶点筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中分别输入关键词“黄芪”“人参”，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18作为活性化合物的筛选条件，筛选出具有较高活性的化合物，再利用Unitprot数据库查询靶点的标准蛋白名称，通过Perl得到药物有效成分的作用靶点。

1.2 胃癌相关靶点筛选

在 DisGeNET数据库中以“gastric cancer”“stomach cancer”为关键词筛选出“胃恶性肿瘤”和“胃腺癌”两个文件，通过整合得到胃癌相关靶点基因。

1.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络

将药物的共同靶点和胃癌相关靶点通过Venny 2.1.0软件得到黄芪-人参药对作用于胃癌的重要靶点，再将重要靶点导入String网站，以Homo sapiens为筛选条件，将置信度设定为＞0.50，隐藏图中孤立的蛋白质，最后输出PPI网络图，并根据分析结果统计靶标蛋白关联频次。获取蛋白PPI信息，通过Cytoscape 3.7.1软件可视化图形进行研究分析，并根据分析结果统计靶标蛋白关联频次。

1.4 基因本位（gene ontology，GO）注释富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

将获得的靶点蛋白代入R语言进行基因代码转换，获得靶点蛋白的entrezID，最后进行GO注释富集分析和KEGG通路富集分析，设置P＜0.05，采用R语言对结果进行可视化。

1.5 黄芪-人参药对的有效活性成分-靶点-通路网络构建

将黄芪-人参药对的有效成分、重要靶点代入Cytoscape 3.7.1建立有效活性成分-靶点-通路网络，并进行可视化。

1.6 有效活性成分-靶点分子对接

将有效活性成分-靶点-通路网络靠前的10个关键靶点和最可能发挥作用的有效活性成分筛选出来，导入AutoDock Vina和Pymol软件进行分子对接验证，构建配体和蛋白质的分子对接直观图。

2 结果

2.1 黄芪-人参药对有效活性成分筛选

通过TCMSP数据库筛选出20个黄芪有效活性化合物、22个人参有效活性化合物，通过Perl数据处理获取黄芪-人参药对有效活性成分的作用靶点141个。

2.2 胃癌相关靶点筛选

通过输入“gastric cancer”“stomach cancer”关键词筛选出“胃恶性肿瘤”和“胃腺癌”两个文件，整合得到胃癌相关靶点，最终合并、删除重复靶点后共筛选出3817个重要靶点，通过Venny 2.1.0网站获得黄芪-人参药对有效活性成分靶点蛋白与胃癌靶点蛋白的交集，二者叠加后获得141个相互作用靶点。

2.3 黄芪-人参药对有效活性成分-靶点-疾病网络构建

根据中药组分、单味药成分、药物靶点与胃癌靶点间的关系，将黄芪-人参药对的有效活性成分和相关作用靶点输入Cytoscape 3.7.1软件，构建药物-有效活性成分-靶点-疾病网络，使有效活性成分与靶点间的关系达到可视化，以探究黄芪-人参药对的药理学作用机制。结果显示，输出的网络图中包含了175个节点，663条边，其中不同颜色、形状的节点分别表示药物名称、有效活性成分、靶点、胃癌，其中紫色圆形节点表示黄芪-人参药对发挥抗胃癌作用的141个关键靶点，淡红色V形节点表示黄芪-人参药对的有效活性成分，橙色六边形节点表示黄芪-人参药对的药物名称，绿色菱形节点表示胃癌，若某一蛋白对某条通路具有调节作用，则通过边连接。说明黄芪-人参药对可以通过多成分、多靶点、多通路发挥胃癌治疗的作用。（图1）

图1 黄芪-人参药对的药物-有效活性成分-靶点-疾病网络图

2.4 PPI网络的构建与分析

将2.3中的关键靶点导入String网站，构建黄芪-人参药对靶标的PPI网络图，设置置信度＞0.50，得到的PPI网络包含99个节点，614条边，平均Degree为12.4，筛选得到靠前的10个靶点蛋白，分别为雄激素受体（androgen receptor，AR）、热休克蛋白90α家族A类成员1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、促分裂原活化的蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、RB转录辅抑制因子1（RB transcriptional corepressor 1，RB1）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、核受体辅激活蛋白1（nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）、p65、AKT 丝氨酸/苏氨酸激酶 1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）。（图2）

图2 黄芪-人参药对治疗胃癌的靶点PPI网络图

2.5 GO注释富集分析和KEGG通路富集分析

GO注释富集分析将黄芪-人参药对治疗胃癌涉及的生物过程、分子功能、细胞成分的前20条富集信息制成气泡图（图3），其中生物过程主要集中于细胞对化学应激的反应、氧化应激反应、脂多糖应答（图3A），分子功能主要富集于DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合（图3B），细胞成分主要集中于膜筏、膜微域、膜区（图3C）。KEGG通路富集分析将筛选出前20条信号通路制成气泡图，其中最显著的5条通路分别为脂质与动脉粥样硬化、化学致癌-受体激活、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、人巨细胞病毒感染（图4）。

图3 黄芪-人参药对的GO注释富集分析

图4 黄芪-人参药对的KEGG通路富集分析

2.6 核心活性成分-靶点分子对接

将筛选排名靠前的10个核心靶点（AR、HSP90AA1、MAPK1、RB1、ESR1、NCOA1、RELA、AKT1、EGFR、Bcl-2）与筛选得到排名靠前的6个有效核心成分（山奈酚、异鼠李素、芒柄花素、毛蕊花素、槲皮素、人参皂苷Rh2）进行分子对接。一般认为结合能≤-5.0 kcal/mol的药物分子与靶点具有较好的结合活性，分子对接结果显示，6大有效核心成分与前10个核心靶点具有广泛的结合活性，其中AR-山奈酚、HSP90AA1-芒柄花素、MAPK1-人参皂苷Rh2、RB1-山奈酚、ESR1-山奈酚、NCOA1-槲皮素、RELA-异鼠李素、AKT1-毛蕊花素、EGFR-毛蕊花素、Bcl-2-山奈酚间的结合活性最显著（表1）。

表1 核心活性成分-靶点分子的结合活性（kcal/mol）

3 讨论

中医认为胃癌是由长期饮食不节、情志失调、劳倦内伤或感受外来邪毒，引起机体阴阳平衡失调、脏腑经络功能失常，出现食滞、痰结、邪毒内蕴等病理性改变，最终形成肿瘤。中药黄芪味甘，性微温，归脾、肺经，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌之功效；人参味甘，偏寒，归肺、脾、胃经，具有补五脏、安精神、定魂魄、除邪气等功效；两药合用，益气健脾。国医大师刘尚义教授常将黄芪-人参药对用于治疗肿瘤后期正气亏损、气阴两伤、脾胃受损[5]。张仲景用具体的治疗案例证实，人参补气固元之力最专，是治疗阳脱的专用药[6]；黄芪具有补气通阳、养血活血的功效，是治疗慢性虚症的专用药。现代实验研究也表明，含有中药黄芪、人参的方剂能抑制胃癌细胞生长、克隆、侵袭和迁移能力，能诱导胃癌细胞凋亡[7]。黄芪、人参配伍可提高机体免疫力进而达到抗肿瘤、抗脑缺血再灌注损伤等的目的[8]。在治疗胃癌时，张翼[9]和李杰等[10]研究结果显示，黄芪-人参药对治疗晚期胃癌的临床疗效优于西药联合治疗，表明中药汤剂不仅以去瘤为主，还兼顾提高机体免疫力，从整体观念治疗，标本兼顾。但黄芪-人参药对治疗胃癌的分子作用机制尚未明确，为此，本研究运用网络药理学和分子对接研究方法进一步探讨黄芪-人参药对治疗胃癌的分子机制及相关信号通路。

本研究最终预测得到黄芪-人参药对共有31个有效化学活性分子及141个作用于胃癌的关键靶点，通过PPI筛选出黄芪-人参药对治疗胃癌前10个最相关的候选靶点，分别为AR、HSP90AA1、MAPK1、RB1、ESR1、NCOA1、RELA、AKT1、EGFR、Bcl-2。其中，ESR1和AR与细胞周期阻断、遗传畸变、基因表达的调控、肿瘤相关生物功能和通路有关[11-12]。有研究对胃癌肝转移进行了免疫组化检测，结果显示，胃癌肝转移过程中HSP90AA1基因不仅在转录和翻译水平上均上调，还在原发性胃癌中表达上调[13-14]。治疗胃癌时，可通过抑制长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）ZNRD1-AS1靶向HSP90AA1轴来调控胃癌细胞的生长，以抑制胃癌细胞的增殖和转移[15]。研究发现，促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路是细胞增殖、凋亡和炎症反应的常见信号转导通路，在肿瘤细胞生长过程中发挥重要作用；同时，MAPK1还可以调节胃癌细胞的生长，并在胃癌进展中发挥关键作用，因此治疗时可通过调节MAPK1的表达调控肿瘤细胞的生长、增殖[16-18]。Jiang等[19]研究表明，抑癌基因MAPK1-109aa通过与丝裂原活化蛋白激酶的激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase 1，MEK1）竞争性结合来抑制MAPK1的磷酸化，从而抑制MAPK1及其下游因子在MAPK通路中的激活，并得出了circMAPK1可作为胃癌预测因子的结论。Umeda等[20]研究显示，Fraser细胞外基质复合亚基 1（Fraser extracellular matrix complex subunit 1，FRAS1）是胃癌肝转移的相关基因，FRAS1可以激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路来影响RB1基因的表达，进一步抑制胃癌的肝转移。同时，RB1也能预测胃癌复发和肝转移[21]。此外，胃癌细胞中经常受到管制的miRNA-215可通过瞄准RB1基因来影响细胞增殖，进而预防胃癌的发生以实现治疗的目的[22]。由此可见，通过对黄芪-人参药对有效活性成分及对应核心靶点的研究发现，黄芪-人参药对中的核心靶点对胃癌细胞具有调节作用，治疗时可通过调节上述靶点基因的表达，在肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和患者的预后中发挥关键作用。

本研究结果显示，通过GO注释富集分析结果分别筛选出黄芪-人参药对治疗胃癌涉及的生物过程、分子功能、细胞成分的前20条富集信息，黄芪-人参药对的化学成分主要通过脂质与动脉粥样硬化、化学致癌-受体激活、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、人巨细胞病毒感染信号通路等发挥作用，抑制肿瘤细胞增殖。此外，黄芪-人参药对中的有效活性分子可以改善胃癌患者的近期症状、诱导胃癌细胞凋亡[23]。

由分子对接结果来看，AR-山奈酚、HSP90AA1-芒柄花素、MAPK1-人参皂苷Rh2、RB1-山奈酚、ESR1-山奈酚、NCOA1-槲皮素、RELA-异鼠李素、AKT1-毛蕊花素、EGFR-毛蕊花素、Bcl-2-山奈酚间均有较好的结合活性。Kim等[24]、Zhang和Ma[25]的研究表明，山奈酚可以抑制胃癌细胞的增殖、促进细胞的自噬和凋亡，并激活了从细胞质到细胞核的肌醇依赖酶l（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）-应激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）-C/Ebp-同源蛋白质（C/Ebp-homologous protein，CHOP）信号转导通路，而组蛋白甲基化转移酶G9a可抑制胃癌细胞中的自噬细胞死亡。同时，使用含有山奈酚成分的药物也能抑制胃癌细胞的生长[26]。槲皮素是一种黄酮类化合物，可以诱导肿瘤细胞凋亡，与抗肿瘤药物联合使用可以增强抗肿瘤药物的疗效[27-28]。本研究结果可以为临床用药提供更有力的参考。

综上所述，黄芪-人参药对中的有效活性成分可以改善胃癌患者的近期症状并诱导胃癌细胞凋亡，从而达到治疗胃癌的目的，为黄芪、人参的临床应用提供了理论支持，对临床有一定的参考价值。