10-羟基-12-十八碳烯酸的静息细胞合成

郭前婉，彭舒悦，王晨晨，赵萌*，Michael G.Gaenzle，2

（1 发酵工程教育部重点实验室 湖北省工业微生物重点实验室 湖北工业大学 武汉430068 2 阿尔伯塔大学农业、食品与营养科学系 加拿大埃德蒙顿 T6G 2P5）

10-HOE 是一种典型的微生物源羟基不饱和脂肪酸，主要通过亚油酸水合酶催化亚油酸，对其顺9 位双键进行羟基化而合成[1-2]。据文献报道，10-HOE 具有良好的真菌抑制效果[3-5]，添加在发酵面包中其抑菌效果堪比商业防腐剂[6-7]；对大脑炎症有潜在的调节和控制作用[8-10]；通过小鼠实验发现10-HOE 还可有效预防过敏性皮炎[11]。10-HOE 在食品、生物医药等领域应用潜力巨大，其高效制备具有重要意义[1，12]。

10-HOE 是微生物合成共轭亚油酸的中间产物，主要是由含有10-亚油酸水合酶的野生菌或重组菌等进行生物合成[13-14]，因而可通过静息细胞法进行生物合成。静息细胞法生物合成的影响因素主要有pH、温度、辅酶及其浓度、底物及菌体浓度等[15-17]。目前，有研究发现化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）[18]，短双歧杆菌（Bifidobacteium breve）[19]，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）[20]，植物乳杆菌（L.plantarum）[20]，嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）[20]，动物双歧杆菌乳酸亚种（Bifidobacterium animalis subsp.Lactis）[20]，汉氏乳杆菌（L.hammesii）[21]，罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）[21]，穗状左乳杆菌（Levilactobacillus spicheri）[21]等菌具备合成10-HOE 的能力。而与一般的野生菌相比，基因工程菌含有高活性、高特异性的胞内酶，可大量表达目标酶，应用到静息细胞转化中，不仅可以有效发挥酶的作用，维持酶的稳定性，而且其细胞转化效率高，产物杂质少，处理更简单[22-23]，是产业化生产10-HOE 的有效途径。

目前，10-HOE 生物合成研究较少[24]，尚未有重组静息细胞大量合成10-HOE 的研究报道。10-HOE 是近年来研究的一种新型功能性脂肪酸，为探索其各种生物活性，有必要大量生产10-HOE，而静息细胞法是10-HOE 生物合成的有效途径。本文利用含有10-亚油酸水合酶的重组大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）/ pET28a-ZS2058-mcra 对底物亚油酸进行静息细胞转化合成10-HOE，通过单因素实验对转化温度、转化pH 值、FAD 浓度、氯化钠浓度、甘油浓度、酶浓度、底物浓度、转化时间等条件进行优化，建立可高效合成10-HOE 的混合体系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘油、乙酸、乙醇，国药集团化学试剂有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、十五烷酸，Sigma-Aldrich 公司；甲醇、正己烷、异丙醇、2-丙醇，Fisher Scientific 公司；卡那霉素，广州赛国生物科技有限公司；FAD，上海麦克林生化科技有限公司；亚油酸、三甲基硅重氮甲烷，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C GC/MS 联用仪，日本Agilent公司；TS-2102C 型恒温摇床，常州金坛良友仪器有限公司；BOXUN 立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业公司医疗设备厂；AIRTECH 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；XW-80A 旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重组大肠杆菌的构建、培养和诱导表达重组大肠杆菌的构建：质粒来源于江南大学，质粒名称为 pET28a -ZS2058 -MCRA（GenBank：JF747255.1）[25]。通过大肠杆菌 DH5α 和BL21（DE3）感受态细胞转化，最终获得可成功表达10-亚油酸水合酶的大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-ZS2058-mcra[24]。

LB 液体培养基：氯化钠10 g/L，酵母浸膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH 7.4～7.6。LB 固体培养基：在上述LB 液体培养基中加入琼脂粉15 g/L。

将在-80 ℃冷冻保藏的2 mL 大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-ZS2058-mcra 接种于100 mL LB液体培养基中，加入50 mg/L 卡那霉素，37 ℃、200 r/min 培养12 h；按4.0%的接种量转接到新的LB液体培养基中，加入50 mg/L 卡那霉素，37 ℃，200 r/min 培养100 min（OD600nm0.6～0.8），加入0.5 mmol/L IPTG（IPTG 溶液为诱导剂，诱导重组细胞对10-亚油酸水合酶基因的表达），继续放入摇床中18 ℃、120 r/min 培养24 h。将诱导培养结束的重组细胞培养液在4 ℃、6 000 r/min 离心30 min，倒掉上清液，获得菌泥，将菌泥分装在2 mL 离心管中，于-20 ℃下冷冻保藏。

1.3.2 静息细胞转化试验 在8 mL 白盖瓶瓶内滴加3 mg 亚油酸液体作为反应底物，沿瓶壁加入50 mg 菌泥，再加入1 mL 磷酸盐缓冲溶液（pH 6.5，20 mmol/L），用旋涡混合器震荡至菌泥混合均匀后，分别在30，35，37，40，45，50 ℃，200 r/min 摇床中培养6 h，研究温度对10-HOE 转化率的影响。在确定温度的基础上，研究pH 值（pH=5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的磷酸盐缓冲溶液）对10-HOE 转化率的影响，其余条件不变。在确定温度、pH 值的基础上，加入（0，0.01，0.025，0.05，0.1，0.25 mmol/L）FAD，研究FAD 浓度对10-HOE 转化率的影响，其余条件不变。在确定温度、pH、FAD浓度的基础上，分别加入不同质量分数（2%，5%，10%）的甲醇、乙醇、正己烷、异丙醇、乙酸乙酯，研究有机溶剂种类及浓度对10-HOE 转化率的影响，其余条件不变。在确定温度、pH 值、FAD 浓度、有机溶剂种类及浓度的基础上，加入0，2%，5%，10%，15%，20%甘油，研究甘油质量分数对10-HOE 转化率的影响，其余条件不变。在确定温度、pH 值、FAD 浓度、有机溶剂种类及浓度、甘油的基础 上，加入0，15，50，100，150，200 mmol/L氯化钠，研究氯化钠浓度对10-HOE 转化率的影响，其余条件不变。在确定温度、pH 值、FAD 浓度、有机溶剂种类及浓度、甘油、氯化钠浓度的基础上，改变菌质量浓度（0，20，50，100，150，200，250 g/L），研究菌浓度对10-HOE 转化率的影响，其余条件不变。在确定温度、pH 值、FAD 浓度、有机溶剂种类及浓度、甘油、氯化钠、菌浓度的基础上，改变亚油酸质量浓度（4，10，20，30，40，50 g/L），研究亚油酸浓度对10-HOE 转化率的影响，其余条件不变。在确定最优条件后，在该条件下转化6，12，24，72 h，研究10-HOE 转化率随时间的变化。

1.3.3 10-HOE 的提取和甲酯化处理 脂肪酸的提取：培养结束后，在转化样品中加入2 mg 十五烷酸作内标，充分混匀，加入1 mL 异丙醇，旋涡震荡仪充分震荡30 s，再加入1 mL 正己烷，充分震荡30 s，在4 ℃、6 000 g 条件下离心30 min，吸取正己烷层氮气吹干，获得脂肪酸样品。

甲酯化：在脂肪酸样品中加入0.2 mL 重氮甲烷，剧烈振荡后，在室温反应30 min，加入50 μL乙酸，2 mL 正己烷，2 mL 超纯 水和100 μL 0.5 mol/L NaOH 溶液，离心取正己烷层，过0.22 μm有机滤膜后装入2 mL 气质瓶中。

1.3.4 气-质谱检测10-HOE 含量 气-质谱检测：安捷伦7890A-5975C。柱型：Agilent 19091S-433，0.25 μm×250 μm×30 m。初始150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升温至200 ℃，保持10 min，再以4 ℃/min 升温至240 ℃，保持10 min，分流比10∶1，溶剂延迟3 min，进样器和检测器温度均为240℃，载气为高纯氦气。

内标法定量：称取10 mg 十五烷酸标样（内标物）、10 mg 亚油酸标样、10 mg 10-HOE，加入1 mL 磷酸盐缓冲溶液（20 mmol/L，pH 6.5），用上述脂肪酸提取，甲酯化的方法处理，然后进行气-质谱检测。

1.4 转化率和相对转化率的计算

响应因子f 的计算：

式中，As——内标物十五烷酸的峰面积（mV×min）；ms——内标物的质量（mg）；Ar——对照物的峰面积（mV×min）；mr——对照物的质量（mg）。

根据含内标物待测物的色谱峰响应值，计算其含量mi（mg）：

式中，f——校正因子；Ai——待测物质的峰面积（mV×min）；As——内标物十五烷酸的峰面积（mV×min）；ms——加入内标物的质量（mg）。

10-HOE 转化率αi的计算：

式中，mi——试样i 中10-HOE 的甲酯衍生物的质量（mg）；m0——试样i 中所含的亚油酸质量（mg）。

相对转化率αri的计算：

式中，α1——每组试验中第1 个试样（对照组）中亚油酸的转化率（%）。

2 结果与分析

2.1 10-HOE 的气-质谱鉴定结果

静息细胞转化产物的气-质谱测定结果如图1a 所示。通过谱库匹配，除内标十五烷酸及底物亚油酸外，有新物质的生成，新物质的质谱图如图1b 所示。其特征碎片169 m/z 及201 m/z 同文献[24]，[26]中报道的10-HOE 质谱图结果相同，与理论碎片值一致。因而，可以确定该新物质为10-HOE。在图1a 中，10-HOE 的色谱峰很高，说明大肠杆菌重组细胞对亚油酸有很好的转化能力，可高效合成10-HOE。

图1 重组大肠杆菌生物合成产物的鉴定Fig.1 Identification of the biosynthesis products of the recombinant E.coli

2.2 转化温度对转化率的影响

图2 显示不同温度下静息细胞转化合成10-HOE 的相对转化率。以30 ℃时转化率为100%，当转化温度37 ℃时，转化率最高，其转化率是30℃的1.5 倍。35，37，40 ℃下的转化率无明显差异。当温度大于45 ℃时，转化率急剧下降，仅为最高转化率的10%左右。最适温度的选择对静息细胞转化至关重要，含有13-亚油酸水合酶的重组菌在40 ℃时转化率最高[27]，而对于含有油酸水合酶的重组菌则在30 ℃时达到最高转化率[28]。温度对生物合成具有重要意义，可以通过影响细胞的生长代谢而影响产物合成[15]，也可直接影响产物的转化合成。最终选择37 ℃进行后续静息细胞转化实验。

图2 转化温度对相对转化率的影响Fig.2 The effect of temperature on the conversion yield

2.3 pH 值对转化率的影响

静息细胞合成10-HOE 的转化率随pH 值变化如图3 所示。随着pH 值偏向中性，转化率逐渐升高，当pH 6.5，7.0 时，转化率达到最大值。pH 值继续增加，转化率明显降低，这有可能是由于10-亚油酸水合酶的活性受到抑制，使转化率降低。不同pH 值条件下酶的活性会有所差异，pH 值直接影响重组菌的生长及酶的催化活性、稳定性。当pH 7.0 时，静息细胞转化仍保持高活性，这是由于重组菌的最适生长pH 范围为7.4～7.6。与本试验结果相似的：含有油酸水合酶的重组菌转化油酸合成10-羟基硬脂酸的最适pH 值为7.5[29]，接近大肠杆菌的最适生长pH 值。最终静息细胞转化的最适pH 值为7.0。

图3 pH 值对相对转化率的影响Fig.3 The effect of pH on the conversion yield

2.4 优化的辅酶因子FAD 浓度

如图4 所示，随着FAD 浓度的增加，菌体对亚油酸的转化率增加，当FAD 浓度达0.25 mmol/L后转化率趋于稳定，相比于未添加FAD 时转化率增加了5 倍。这是因为10-亚油酸水合酶具有辅酶因子依赖性，在静息细胞转化过程中，添加辅酶因子FAD 有利于10-HOE 的合成。来源于溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）的油酸水合酶具有更明显的FAD 依赖性，当转化体系不含FAD时，含油酸水合酶的重组菌不具有催化活性，随着FAD 浓度的增加，其催化活性增加，当FAD 浓度在0.2 mmol/L 以上时含油酸水合酶的重组菌催化活性达到稳定[30]。辅酶因子可与酶结合，刺激酶的活性，促进酶对产物的催化合成，参与电子、基团等的传递，合适的辅酶因子浓度可以增加细胞的转化效率[17]。最终最适FAD 浓度为0.25 mmol/L。

图4 FAD 浓度对相对转化率的影响Fig.4 The effect of the FAD concentration on the conversion yield

2.5 优化的有机溶剂及其浓度

图5 显示不同有机试剂对菌体转化的影响。在2%添加量的情况下，添加甲醇、乙醇对转化有抑制作用，而添加乙酸乙酯、异丙醇及正己烷有利于菌体转化，且正己烷效果最好，其转化率约为未添加有机试剂的3.8 倍。然而，有机试剂浓度增加到一定值后，菌体的转化率明显降低。对于静息细胞转化而言，有机溶剂不仅作为助溶剂提高底物的溶解度，还对细胞进行透性化处理来促进细胞转化[27]。细胞透性化处理主要是在改变细胞膜通透性的同时，不破坏细胞整体有机体系，使得一些小分子和较大分子物质能够自由进出细胞，使胞内酶在相对稳定的细胞环境中充分发挥作用，提高菌体的催化效率[31]。与赵伟睿等[32]的研究结果相同，正己烷具有低介电系数，且疏水性较高，对酶分子的稳定性影响较小，有助于提高酶的催化活性，从而提高了转化率。最终选择2%的正己烷添加到菌体转化体系。

图5 有机试剂对转化率的影响Fig.5 The effect of organic reagent on the conversion yield

2.6 优化的甘油浓度

据报道，有机溶剂存在时，甘油对生物细胞具有一定的保护作用，还可为生物细胞提供一定的热稳定性[33-34]。甘油浓度对转化率的影响如图6 所示。随着甘油含量的增加，转化率均略有降低，未有明显的抑制作用。甘油的作用是在冷冻过程中保护菌体，不一定有利于菌体的转化。转化率降低可能是由于甘油增加了转化体系的黏度，阻碍了振荡过程中菌体与底物的结合。另一个原因可能是甘油浓度升高造成高渗透压环境，抑制细胞内10-亚油酸水合酶的活性，从而降低菌体合成10-HOE 的转化率。选择不添加甘油做后续试验。

图6 甘油浓度对相对转化率的影响Fig.6 The effect of the glycerol concentration on the conversion yield

2.7 优化的氯化钠浓度

不同浓度的氯化钠对静息细胞转化合成10-HOE 转化率的影响如图7 所示。当氯化钠浓度为15 mmol/L 时，能够增加转化率，当其浓度过高时，转化率无明显变化。Gandhi 等[35]研究发现当氯化钠质量分数超过临界值2.5%时，会抑制大肠杆菌的生长，从而影响其催化活性。添加适量的氯化钠可以维持细胞内、外渗透压，渗透压过高或过低均不利于菌的存活及内、外物质交换[36]。在后续试验中选择氯化钠最适浓度15 mmol/L。

图7 氯化钠浓度对相对转化率的影响Fig.7 The effect of the NaCl concentration on the conversion yield

2.8 优化的菌浓度

菌浓度对静息细胞转化合成10-HOE 转化率的影响如图8 所示。转化率随菌浓度的增加而增加，当菌质量浓度达200 g/L 后，转化率无明显变化。这是由于参与细胞转化的菌浓度越高，含有10-亚油酸水合酶越多，合成10-HOE 的能力越强，而当菌浓度与底物达到饱和状态时，转化率不再明显上升。这与13-LHT 全细胞催化亚油酸合成13-HOE 的结果相似，13-HOE 浓度随细胞浓度的增加而增加，当细胞质量浓度在25 g/L 以上时趋于稳定，转化率约为70.0%[27]。选择菌质量浓度为200 g/L 进行后续试验。

图8 菌浓度对转化率的影响Fig.8 The effect of the E.coli concentration on the conversion yield

2.9 优化底物浓度

细胞转化结果如图9 所示。随着亚油酸浓度的增加，10-HOE 的转化率呈先增大后减小的趋势。当亚油酸质量浓度为10 g/L 时，10-HOE 转化率为（68.3±3.9）%；当亚油酸浓度增加至20 g/L时，转化率迅速降低，说明此时亚油酸达到饱和。与13-LHT 细胞转化亚油酸的结果类似，产物13-HOE 的浓度随底物亚油酸浓度的增加而增加，当亚油酸质量浓度为250 g/L 时达到饱和，13-HOE转化率随亚油酸浓度的增加而慢速减小[27]。据报道，底物和产物浓度对全细胞催化合成脂肪酸有很大的影响，胞内、外的浓度过高，对合成有一定的抑制作用[17]。以10 g/L 的亚油酸为底物时转化率最高，而以20 g/L 的亚油酸为底物时，其转化率仍有（50.7±1.6）%。为了提高生产效率，选择20 g/L亚油酸为底物进行后续实验。

图9 亚油酸质量浓度对转化率的影响Fig.9 The effect of linoleic acid concentration on the conversion yield

2.10 转化进程曲线

混合体系静息细胞合成10-HOE 的转化率随时间的变化如图10 所示。以20 g/L 亚油酸为底物，加入的细胞质量浓度为200 g/L，随着转化时间的增加，转化率增加，而转化速率先增大后减小。催化反应12 h 内转化率增长最快，转化12 h时，转化率达（62.2±1.7）%，此后转化速率增加速度明显减小；24 h 时转化率为（73.1±0.9）%，10-HOE 质量浓度为（16.3±0.2）g/L；转化72 h 时，转化率达（81.5±1.3）%。Kishimoto 等[37]利用野生菌副干酪乳杆菌副干酪亚种（Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei JCM 1111），以2 g/L 亚油酸为底物，在pH 6.5、30 ℃条件下转化148 h，10-HOE 的合成转化率达91%，是目前生物合成10-HOE 产量最高的报道。本研究利用重组大肠杆菌以20g/L 的底物质量浓度在24h 内合成率达73.1%，极大地提升了10-HOE 的生物合成效率。

图10 最优条件下大肠杆菌静息细胞法合成10-HOE 的时间曲线Fig.10 Time-course reaction of 10-HOE biosynthesis using E.coli resting cell system under optimal conditions

3 结论

通过气相色谱-质谱联用仪对混合体系静息细胞合成10-HOE 的条件进行优化。经单因素优化，得到混合体系静息细胞合成10-HOE 的最佳条件为：20 g/L 亚油酸、pH 7.0 的20 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液、200 g/L 菌泥、0.25 mmol/L FAD、2%正己烷、15 mmol/L 氯化钠，恒温摇床37 ℃、200 r/min 转化24 h，最优转化率为（73.1±0.9）%。与初始条件相比，优化的静息细胞合成10-HOE 的转化率得到很大提升。本文基于混合体系的重组菌静息细胞转化法合成10-HOE，方法操作简单，生产效率高，10-HOE 的纯度高，为静息细胞合成10-HOE 的工业生产提供技术参考。