光谱法和分子对接研究高儿茶酚与牛血清白蛋白的相互作用

吕艳芳，张紫卿，梁倩倩，李营，刘欣欣，李学鹏*

（1 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁锦州121013 2 上海交通大学农业与生物学院 上海 200240）

高儿茶酚（Homocatechol），又称3，4-二羟基甲苯，化学式为C7H8O2，是一种芳香族衍生物，槲皮素代谢的产物，可通过还原木质素衍生的香草醛，然后脱甲基来制备[1-2]，结构见图1。其用途大致可分为3 类：第1 类，可作为中间体制造苹果型香料、农药、染料等[3]；第2 类，可用于杀菌防腐[3]；第3 类，可用于医药领域制备具有医药活性的化合物，并且该物质在抗氧化方面有良好的应用[4-5]。Applová 等[6]在研究中发现高儿茶酚能有效抑制血小板聚集，甚至比临床上使用的抗血小板药物阿司匹林疗效更好。Hsiao 等[7]通过小鼠实验发现高儿茶酚能够缩短热阵痛时间，刺激多种神经营养素，促进皮肤神经再生。Fukuhara 等[8]通过给大鼠侧脑室静脉注射高儿茶酚，发现能够预防大鼠的慢性疼痛并产生抗抑郁作用。刘春丽等[9]和肖卓炳等[10]通过研究荔枝果肉和猕猴桃变软与其多酚氧化酶的关系时，发现在多种底物中，高儿茶酚与其多酚氧化酶能较好地结合。

图1 高儿茶酚的3D（a）和2D（b）结构图Fig.1 3D（a）and 2D（b）structures of homocatechol

蛋白质是生物体最重要的大分子之一，是一切生命活动的物质基础。若小分子参与生物代谢或者可以改变生物大分子的某种理化性质，则研究二者间的相互作用，揭示其作用机理很有意义。牛血清白蛋白（BSA）分子质量为66.4 ku，是一种球状心形蛋白[11-12]。因其与人血清白蛋白是同源蛋白[13-14]，故可广泛用于蛋白质与小分子互作的研究。姚惠芳等[15]、孙艳辉等[16]运用光谱法研究笃斯越橘花青素和绿原酸与BSA 的互作，结果发现，笃斯越橘花青素主要依靠静电作用力，绿原酸主要依靠疏水作用力与BSA 发生作用，其猝灭类型均为静态猝灭。

本文从热力学角度研究高儿茶酚与BSA 的结合作用。研究二者结合后BSA 的三维结构和微观形态的变化。利用分子对接技术分析二者的结合位点，旨在为高儿茶酚的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BSA（≥98%），北京中生瑞泰科技有限公司；高儿茶酚（≥99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾（分析纯），上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

紫外-可见分光光度计（UV2550），日本岛津；荧光分光光度计（970CRT），上海棱光公司；冷场发射扫描电镜（S-4800），日本日立公司；电热恒温水浴锅（DK8D），上海一恒科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 紫外光谱法测定高儿茶酚与BSA 的相互作用 在7 支试管中分别加入2.5 mg/mL，BSA 溶液0.5 mL，接着加入2×103μmol/L 高儿茶酚溶液（0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL），最后用PBS 缓冲液（pH 7.4）定容5 mL，使BSA 终质量浓度为0.25 mg/mL，高儿茶酚的终浓度分别为0，20，40，60，80，100 μmol/L 和120 μmol/L。混匀后 于298 K 下静置10 min。紫外光谱扫描范围200～600 nm。

1.3.2 荧光光谱法测定高儿茶酚与BSA 的相互作用 取24 支试管，分为3 组，每组8 支。按1.3.1节的方法配制溶液，使BSA 终质量浓度为0.25 mg/mL，高儿茶酚的终浓度分别为0，20，40，60，80，100，120 μmol/L 和140 μmol/L。将混合后的3组样品分别置298，310 K 和320 K 恒温水浴中10 min。荧光检测条件：激发波长281 nm，扫描范围280～450 nm，狭缝宽度均为5 nm。

1.3.3 荧光猝灭与热力学计算公式 在1.3.2 节基础上，通过Stern-Volmer 方程（1）对荧光数据进行计算，分析其猝灭类型[17]。通过公式（2）计算其结合常数Ka和结合位点数n[18]。根据方程（3）、（4）计算高儿茶酚与BSA 互作的热力学参数[19]。

式中：F0和F——加入高儿茶酚前、后BSA的荧光强度；Ksv——动态猝灭常数；Kq——猝灭速率常数；τ0——猝灭剂不存在时生物大分子的平均寿命（10-8s）；Ka1和Ka2——分别为T1、T2温度下的结合常数；R——气体常数（8.314×10-3kJ/mol）[20]。

1.3.4 同步荧光法测定高儿茶酚与BSA 的相互作用 方法同1.3.1 节。荧光光谱扫描条件：激发波长281 nm，扫描范围200～400 nm，Δλ 分别为15 nm 和60 nm，狭缝宽度均为1 nm。

1.3.5 高儿茶酚对BSA 形态的影响 在3 支试管中分别加入0.25 mg/mL BSA 溶液0.5 mL，接着加 入2×102μmol/L 高儿茶酚溶液（0，0.05，0.10 mL），用去离子水定容5 mL，使BSA 终质量浓度为0.025 mg/mL，高儿茶酚的终浓度分别为0，2，4 μmol/L。混合溶液于298 K 下静置10 min，在培养皿中放入导电硅片，吸取10 μL 样品溶液平铺在硅片上，放入35 ℃烘箱中直至样品完全干燥。将样品粘贴在样品台上，喷金后扫描电镜观察。

1.3.6 分子对接研究高儿茶酚与BSA 的结合 BSA的晶体结构（ID：4F5S）从PDB 数据库中获得，利用PyMol 软件对晶体结构进行前处理。配体高儿茶酚的2D 结构由Chem Draw 软件绘制，通过Chem3D 软件对其优化，将能量优化后的配体保存为PDB 格式文件，然后利用Auto Dock-vina 软件进行分子对接，最后用Discovery Studio（简称DS）、PyMol 软件作图，查看对接结果。

2 结果与分析

2.1 高儿茶酚与BSA 相互作用的紫外吸收光谱分析

从图2a 可以看出高儿茶酚的最大吸收波长（λmax）在279 nm 处，随着高儿茶酚浓度的增加，它的吸光值由0.032 增至0.357，而其吸收波长没有发生改变。从图2b 可以看出，当不添加高儿茶酚时，BSA 在277 nm 处有一个由BSA 的色氨酸（Trp）与酪氨酸（Tyr）残基的芳杂环π-π*跃迁引起的吸收峰[21]。加入高儿茶酚后，当其浓度为20～80 μmol/L 时，BSA 的吸光值由0.125 增至0.333，且波长从277 nm 红移至279 nm，说明高儿茶酚与BSA 形成了复合物，在这个过程中BSA 结构内部的Trp 与Tyr 残基暴露在蛋白质结构表面，使BSA 的疏水性增强，空间构象发生改变[22-23]。当高儿茶酚浓度超过80 μmol/L 时，BSA 的吸光值增加，其波长仍保持不变，说明二者结合较好，复合物的结构趋于稳定，二者之间发生相互作用[24]。

2.2 高儿茶酚与BSA 相互作用的热力学分析

2.2.1 高儿茶酚与BSA 相互作用的荧光光谱分析 通常蛋白质的荧光是由色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸残基（Phe）引起的[25]。由图3 可知，当BSA 质量浓度为0.25 mg/mL 时，3 种温度下，不添加高儿茶酚的BSA 分别在347，349 nm和345 nm 处有一个强荧光发射峰。添加高儿茶酚后，3 个温度下BSA 的荧光强度随高儿茶酚浓度的增加均呈下降趋势。当温度为298 K 和310 K时，最大发射波长出现蓝移的现象；温度为320 K时，最大发射波长先红移后蓝移，这说明高儿茶酚与BSA 发生了相互作用[26]，且BSA 的峰形和强度没有发生明显变化，表明高儿茶酚的加入没有破坏发色团[27]，仅使蛋白质周围的微环境发生改变，内源荧光发生猝灭，蛋白质的疏水性增强。

图3 298（a）、310（b）和320 K（c）时不同浓度的高儿茶酚与BSA 相互作用的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra of the interaction between BSA and homocatechol of different concentrations at 298（a），310 K（b）and 320 K（c）

2.2.2 高儿茶酚对BSA 的猝灭类型的判定 动态猝灭的猝灭常数（Ksv）随着温度的上升而增大，静态猝灭反之[28-30]。3 个温度下，[Q]与F0/F 拟合出来的曲线线性关系良好（图4）。由表1 可知，随着温度的升高，Ksv由4.80×103L/mol 增至1.663×104L/mol，推测高儿茶酚对BSA 的荧光猝灭过程是动态猝灭；又因其Kq值由0.480×1012L/（mol·s）增至1.663×1012L/（mol·s），大于各类猝灭剂对生物大分子的最大碰撞猝灭速率常数阈值（2.0×1010L/（mol·s））[31]。这表明二者在结合的过程中也存在静态猝灭。

表1 不同温度条件下高儿茶酚与BSA相互作用的猝灭常数Table 1 Sterne-Volmer quenching constants of the interaction between homocatechol and BSA at different temperatures

图4 298，310 K 和320 K 时高儿茶酚和BSA相互作用的Stern-Volmer 拟合图Fig.4 Sterne-Volmer plot of the interaction between homocatechol and BSA at 298，310 K and 320 K

2.2.3 高儿茶酚与BSA 作用的结合位点与结合常数 在2.2.2 节分析中发现，二者结合过程中存在静态猝灭。根据公式（2），以lg[（F0-F）/F]为纵坐标，lg[Q]为横坐标绘制双对数图（图5），对它们的结合方式进行分析。由表2 可知，随着温度的升高，高儿茶酚与BSA 之间的Ka值不断增大，尤其是当温度为320 K 时，Ka达到1.535×106L/mol，远大于5.908×102L/mol，说明高儿茶酚能与BSA 形成复合物，且温度升高显著提高了复合物的稳定性，进一步证明高儿茶酚对BSA 的猝灭以动态猝灭为主[32-33]。在298，310 K 和320 K 时，结合位点数分别为0.763，1.197 和1.518 接近于1，说明二者之间至少存在1 个结合位点。从数值上看，结合位点数有增大的趋势，均未超过2，推测随着温度的升高，二者的结合位点可能会超过一个[34]。综上所述，高儿茶酚对BSA 的猝灭可能是以动态猝灭为主，也有静态猝灭的过程。

图5 298，310 K 和320 K 时高儿茶酚与BSA相互作用的双对数图Fig.5 Double logarithmic plot of the interaction between homocatechol and BSA at 298，310 K and 320 K

表2 298，310 K 和320 K 高儿茶酚和BSA相互作用的结合常数与结合位点数Table 2 Binding constants and number of binding sites of interaction between homocatechol and BSA at 298，310 K and 320 K

2.2.4 高儿茶酚与BSA 的热力学参数和作用力类型 由表3 可知，3 个温度下的吉布斯自由能（ΔG）均为负数，表明高儿茶酚与BSA 之间的结合反应是自发进行的；熵变（ΔS）和焓变值（ΔH）分别为1 002.567 J/（mol·K）和282.779 kJ/mol，均大于0，说明二者在结合过程中熵增明显，属于吸热反应，且温度升高有助于增加复合物的稳定性，疏水作用力是该反应的主要驱动力[35-37]。这与杨荣荣等[38]研究的槲皮素与BSA 结合的作用力类型，俞波等[39]研究酒石酸美托洛尔与BSA 的相互作用力类型相同。

表3 高儿茶酚和BSA 相互作用的热力学参数Table 3 Thermodynamic parameters of the interaction between homocatechol and BSA

2.3 高儿茶酚与BSA 相互作用的同步荧光光谱分析

同步荧光光谱中Δλ 为15 nm 和60 nm 时，分别反映蛋白质中酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）残基的光谱特征，它们的最大荧光发射波长与周围环境的极性有关[40]。从图6a、6b 可以看出，当不加入高儿茶酚时，BSA 的Tyr 和Trp 残基的最大发射波长分别在303 nm 和346 nm 处；随着加入的高儿茶酚浓度的增大，Tyr 与Trp 残基的荧光峰分别红移了1 nm 和3 nm；Tyr 残基的荧光强度出现先增加后下降的趋势；Trp 残基的荧光强度则呈现出下降趋势，其峰形均无明显变化，这表明高儿茶酚的加入不仅引起Tyr 与Trp 残基周围的微环境发生改变，还会降低其疏水性，使肽键的伸展程度有所增加。由2.2.3 节可知，高儿茶酚与BSA 之间至少存在一个结合位点，从Tyr 与Trp 残基荧光峰的红移程度来看，推测出高儿茶酚结合在BSA 的Trp 残基附近。

图6 高儿茶酚与BSA 相互作用的同步荧光光谱：Δλ=15 nm（a）；Δλ=60 nm（b）Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of the interaction between homocatechol and BSA：Δλ=15 nm（a）and Δλ=60 nm（b）

2.4 BSA 与高儿茶酚相互作用前、后微观形态变化

从图7a 可以看出不添加高儿茶酚时，BSA 呈近似正方体，分布均匀，存在蛋白颗粒聚集现象。图7b（2 μmol/L）与图7a 比较，添加高儿茶酚后，BSA 的聚集现象减少了，说明高儿茶酚的加入，促进了BSA 在溶液中的溶解，因此图7b 中蛋白质颗粒比较分散。当高儿茶酚浓度继续增加时，蛋白质颗粒开始聚集，如图7c（4 μmol/L）所示。从这个结果推测，高儿茶酚浓度在一定范围，可能会促进蛋白质的溶解；当高儿茶酚浓度高于2 μmol/L 时，使蛋白质发生聚集。

图7 高儿茶酚与BSA 相互作用的扫描电镜图（×20.0 K）Fig.7 Scanning electronic microscopy images of interaction between homocatechol and BSA（×20.0 K）

2.5 高儿茶酚与BSA 相互作用的分子对接分析

分子对接结果表明，结合能量越低，大分子与小分子之间结合越紧密[41]。根据表4 可知，第3 种模型的结合能为-5.0 kcal/mol，有4 个疏水键和2个氢键，表明高儿茶酚与BSA 能够紧密结合。王晓霞等[42]研究了盐酸四环素与BSA 相互作用，其结合位点在亚结构域IIA（siteⅠ）。另外，小分子与BSA 的结合位点通常存在于亚结构域ⅡA 和ⅢA的子域中，即位点siteⅠ与siteⅡ[43]。由图8a 可知，高儿茶酚结合在BSA 亚结构域IIA 的疏水腔中（位点siteⅠ）；从图8b、8c 可以看出，高儿茶酚与BSA 结合后，形成的化学键主要是疏水键，这一结论与热力学实验结论一致。高儿茶酚通过疏水相互作用与BSA中的Ala209、Ala212、Leu346 和Leu480 结合，键长分别为4.20，5.28，4.27 Å 和5.32 Å。从图8c 还可看出，高儿茶酚与BSA 结合的过程中还形成两个常规氢键（O···H-X），一个是Lys350 的羧基氧与高儿茶酚羟基的氢形成的，键长为4.41 Å；另一个是与Glu353 羧基氧形成的，键长为5.06 Å，这些氢键在维持蛋白质结构中起重要的作用。以范德华力结合作用的氨基酸残基有Val481、Leu330、Ala349、Arg208、Leu326，虽然范德华力是一种较弱的作用力，但是对维持复合物空间结构的稳定性起到支持作用。高儿茶酚被氨基酸残基形成的疏水口袋包围着，结合在Trp213 附近（图8c），通过疏水作用力与BSA 相互结合形成复合物，进一步说明高儿茶酚能够猝灭BSA 的内源荧光，该结果与荧光光谱试验结论相同。

表4 高儿茶酚和BSA 相互作用主要对接结果Table 4 Main docking results of interaction between homocatechol and BSA

图8 高儿茶酚与BSA 相互作用的分子对接图Fig.8 Molecular docking diagram of interaction between homocatechol and BSA

3 结论

本研究发现，高儿茶酚对BSA 的猝灭过程是以动态猝灭为主，也存在静态猝灭。根据热力学参数计算得出，ΔS、ΔH 为正值，ΔG 为负值，推测高儿茶酚与BSA 形成的复合物主要以疏水作用力来维持稳定，二者结合过程是自发进行的。结合位点数n 接近于1，且随着温度的升高不断增大，这说明高儿茶酚在BSA 上至少存在一个结合位点。2 μmol/L 的高儿茶酚能够促进蛋白的溶解，而当高儿茶酚浓度高于2 μmol/L 时，部分蛋白又重新发生聚集。从分子对接结果看，高儿茶酚在BSA的疏水性口袋结构内部存在一个结合位（siteⅠ），距离Trp213 很近。结合光谱试验结果，加入高儿茶酚改变了BSA 的Tyr 和Trp 残基周围的微环境，最终猝灭Tyr 和Trp 残基的内源荧光。