改良的亚油酸—硫氰酸钾显色法在抗氧化实验教学中的应用

刘金钏　袁尔东　严慧玲　任娇艳

摘 要 通过减少亚油酸加入量并加入氧化促进剂，对传统的亚油酸-硫氰酸钾显色法加以改进，使基于该法的抗氧化实验得以在本科实验教学中成功实施。该法耗时较少，实验数据合理，重现性良好。

关键词 亚油酸 硫氰酸钾 抗氧化实验 实验教学

中图分类号：G424 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2017.12.059

Application of a Modified Linoleic Acid-KSCN Method on Antioxidation in Experimental Teaching

LIU Jinchuan， YUAN Erdong， YAN Huiling， REN Jiaoyan

（National Institute of Light Industry and Food Experimental Teaching Demonstration Center， School of Food Science and Engineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510641）

Abstract By reducing the amount of linoleic acid and adding to the traditional oxidation accelerator， linoleic acid potassium thiocyanate colorimetric method is improved， so the method of antioxidation experiment has been successfully implemented in undergraduate experimental teaching based on. This method has less time， reasonable experimental data and good reproducibility.

Keywords linoleic acid； KSCN； antioxidation experiment； experimental teaching

油脂是生物体及其食品的重要组成部分。油脂的氧化酸败不仅会对食品的风味、色泽等产生影响，导致食品品质下降和产品货架期的缩短；另一方面，生物体内的脂质氧化会对生物膜、酶、蛋白质等造成破坏，可能导致衰老和癌变，从而危害机体健康。外源性抗氧化剂可有效延缓油脂及含油食品的氧化变质，并有助于维持生物体的氧化还原平衡，因此，抗氧化剂在食品、保健品及药品中均具有广泛的应用前景。通过实验教学阐述抗氧化剂抑制油脂氧化的作用有利于学生理解掌握油脂的氧化原理及抑制油脂氧化的方法，对于食品专业的学生非常有益。

亚油酸-硫氰酸钾显色法是应用最广泛的抗氧化性检测方法之一。然而，由于该法耗时较长，且受样品的乳化特性影响较大，实验结果不稳定，目前在食品生物化学实验教学中甚少开展相关实验项目。本实验以大豆蛋白水解液（大豆肽混合液）及二氢杨梅素为抗氧化剂，研究其对亚油酸过氧化的抑制作用，并对经典的亚油酸-硫氰酸钾显色法进行了改良，可有效缩短实验时间，并减少样品的乳化特性干扰，具有良好的重复性，适合在本科实验教学中应用。

1 实验

1.1 试剂与仪器

亚油酸、2， 2-偶氮-二（2-甲基丙基咪）-二盐酸盐（AAPH）购于阿拉丁试剂（上海）有限公司；二氢杨梅素样品为藤茶中提取后经六次重结晶后获得的自制样品（纯度>95%），用乙醇配成0.5mg/mL溶液备用；其余试剂为国产分析纯。所使用的仪器为电热恒温水浴锅和美普达UV1800型可见光分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆蛋白水解液（大豆肽混合液）的制备

称取大豆蛋白5.0g，用水配成5%溶液，并用NaOH调节pH7.0，加入80mg木瓜蛋白酶（酶活1000U/mg），于60℃水浴酶解2小时，沸水浴加热5min灭酶，8000r/min离心5min，取上清液备用，即为待测大豆肽混合液。

1.2.2 亚油酸过氧化反应体系

取5mL具塞玻璃试管，加入一定量的抗氧化剂溶液，用溶剂补足至400 L，随后加入2.5%（v/v）亚油酸100 L以及0.05mol/L pH7.0磷酸盐缓冲溶液3mL，为加速氧化过程，在体系内加入0.05mol/L AAPH水溶液40 L或0.025mol/L FeCl2-EDTA溶液100 L，混匀密闭，于60℃恒温水浴锅中避光反应。反应120min后检测各试管反应液中亚油酸的过氧化情况，了解抗氧化剂对亚油酸过氧化的抑制作用。

1.2.3 硫氰酸盐显色法检测亚油酸的氧化情况

取0.15mL上述反应液，依次加入0.02mol/L溶解于3.5%HCl中的FeCl2溶液0.45mL、30% KSCN溶液0.3mL、75%乙醇4.5mL，混匀。准确反应5min后，测定500nm波长下的吸光度（以无水乙醇为参比）。吸光度值越低，说明亚油酸的过氧化情况越少。所有结果均为试验三次的平均值。

2 实验结果

2.1 大豆肽混合液对亚油酸过氧化的抑制作用

图1反映了大豆肽混合液对亚油酸过氧化的抑制作用，随着大豆肽混合液的添加量的增加，亚油酸过氧化的程度逐渐降低，显示大豆肽混合液有明显的抗氧化作用。

2.2 二氢杨梅素对亚油酸过氧化的抑制作用

图2反映了二氢杨梅素对亚油酸过氧化的抑制作用，随着二氢杨梅素的添加量的增加，亚油酸过氧化的程度逐渐降低，显示二氢杨梅素有明显的抗氧化作用。

3 讨论

由于油脂的氧化是个相对较为缓慢的过程，用传统的亚油酸-硫氰酸钾显色法研究抗氧化剂对亚油酸的抗氧化作用时，通常需要数天的时间才能得到显著的效果，因此不适于应用于课堂教学中。加入微量过渡金属离子或自由基引发剂AAPH可催化加速油脂的氧化过程，Nagai[1]、余芳[2]、吴建中[3]等均在相关的研究中应用加速剂加速亚油酸的氧化过程。然而，要在短短2个小时内仅靠加速剂仍不能获得满意的实验结果，反应液显色后的吸光值重复性较差，且无法体现组别间的差异，甚至会出现与抗氧化剂实际抗氧化能力不符的实验结果。吴建中[3]认为造成这种现象的原因可能在于反应体系中试剂的乳化性质对抗氧化性质的研究有着明显的影响。当体系中的亚油酸较多时，容易出现油水分离现象，有絮状油脂析出，乳浊液体系呈现明显不稳定现象。这对体系的局部反应速度、取样的均匀性等均有显著的影响，有可能导致乳化性好但抗氧化性差的抗氧化剂显示出较强的抗氧化活性。因此，为降低乳化特性的干扰，我们参照吴建中[3]的方法进行实验设计并做了进一步改进：（1）大幅度减少体系中的亚油酸的加入量，为文献[3]中的50%；（2）为防止体系中产生的过氧化脂质太少，影响了检测方法的灵敏度，在体系中加入微量FeCl2-EDTA或AAPH等加速氧化进程。课堂实践表明，该方法可在常规实验学时内产生足够的过氧化脂质，实验结果重现性良好，适合于食品相关专业学生在实验课程中理解油脂的氧化及用亚油酸-硫氰酸钾显色法评价各种抗氧化剂的抗氧化能力的方法，预期效果良好。

参考文献

[1] T Nagai， M Sakai， R Inoue， et al. Antioxidative activities of some commercially honeys， royal jelly， and propolis[J].Food Chemistry，2001.75（2）：237-240.

[2] 余芳，安辛欣.富硒綠茶中茶多酚及水提物的抗氧化活性研究[J].江苏农业科学，2012.40（8）：298-300.

[3] 吴建中.大豆蛋白的酶法水解及产物抗氧化活性的研究[D].华南理工大学，2003.endprint