CD2相关蛋白与其他足细胞相关蛋白间互相作用的研究进展▲

王 琼 刘运广 董凯华 颜嘉葳

(1 右江民族医学院研究生学院，广西百色市 533000,电子邮箱：1834252464@qq.com；2 右江民族医学院附属医院儿科，广西百色市 533000；3 首都医科大学附属北京地坛医院儿科,北京市 100015)

【提要】 足细胞足突融合消失和蛋白尿是肾小球疾病的共同特征，了解足细胞的生物学特性，对研究足细胞损伤机制、靶向治疗具有重要意义。裂孔隔膜作为足细胞重要组成部分之一，对维持肾小球滤过屏障结构及功能、限制蛋白滤过起关键作用。CD2相关蛋白(CD2AP)作为裂孔隔膜的代表性蛋白之一，与细胞骨架相关蛋白、其他裂孔隔膜蛋白、基底膜区蛋白、顶膜区蛋白和离子通道蛋白存在相互作用，共同影响足细胞形态学和动力学。本文围绕CD2AP与足细胞相关蛋白的相互作用进行综述，为探讨蛋白尿的发生机制提供参考。

蛋白尿是肾脏疾病的主要标志，同时也是导致肾功能恶化进展的独立因素，其严重程度可反映肾脏病变的严重程度[1]。蛋白尿的发生与肾脏的滤过屏障结构完整性破坏密切相关。有学者借助分子生物学研究手段，发现足细胞相关蛋白在维持肾脏滤过功能上发挥重要作用，并且不同蛋白之间关系密切[2-3]。CD2相关蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)作为重要足细胞分子之一，在维持肾脏滤过屏障的结构及功能完整性上起着重要作用。本文主要就CD2AP与其他足细胞相关蛋白之间相互关系做一综述。

1 足细胞的结构与功能

肾小球滤过屏障可阻止包括白蛋白在内的血浆大分子进入尿液，该结构由电荷屏障和机械屏障构成，其中机械屏障由有孔的内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞组成。足细胞是一种终末分化细胞，其作为构成肾小球滤过屏障的最后一道屏障，附着于肾小球毛细血管襻的外侧。足细胞可分为结构和功能不同的3个部分：细胞体、初级突起(亦称主突)、足突。相邻足细胞的足突呈相互交叉嵌合，并形成宽约40 nm的滤过裂孔，裂孔由极薄的裂孔隔膜相连，成为阻止蛋白质等大分子滤过的最后屏障。足细胞正常功能的发挥及其在肾小球基底膜上的稳定附着，均依赖于足细胞相关蛋白的维持。而根据足细胞的分布情况和功能，足细胞相关蛋白可分为细胞骨架蛋白、裂孔隔膜蛋白、基底膜区蛋白、顶膜区蛋白、离子通道蛋白，这些蛋白共同构成肾小球滤过屏障，能够有效选择血浆中的滤过成分，从而维持内环境的稳定。

2 CD2AP

CD2AP是人足细胞裂孔隔膜特异性表达的蛋白。在空间结构上，CD2AP由中央的卷曲线圈域和外周的4个对称基序构成，而外周的每个基序中均含有3个SH3球状结构域；从氨基酸序列上看，CD2AP的NH2末端包含3个SH3结构域，中间区域为富含脯氨酸区域，COOH末端包含一个卷曲螺旋结构域和肌动蛋白结合位点[4]。其中，CD2AP的SH3结构域与脯氨酸线性识别序列结合。Rouka等[5]研究了每个SH3结构域与已知交互因子Casitas B谱系淋巴瘤蛋白(Casitas B-lineage lymphoma，CBL)的结合特性，并进行了基于识别PxPxPR基序的肽微阵列筛选，发现多种可结合蛋白，如CBL、凋亡相关基因2相互作用蛋白X(apoptosis-linked gene 2-interacting protein X，ALIX)、Ras和Rab结合因子3分子等；3个SH3结构域对这些结合蛋白的识别和结合存在显著差异：CD2AP的SH3-1和SH3-2结构域通常与具有相似特征的肽配体结合，而SH3-3结构域与大多数的肽配体结合较弱，但可识别ALIX中异常延伸的序列。有研究表明SH3-3的一个突变(p.K301M)可能在遗传性局灶节段性肾小球硬化中起作用[6]。有学者进一步研究发现，CD2AP的SH3-1结构域Y10位的酪氨酸对于维持其自身功能不可或缺[7]。

3 CD2AP与其他足细胞相关蛋白之间的相互作用

3.1 CD2AP与细胞骨架蛋白之间的相互作用 足细胞胞体和主突的细胞骨架是由微管和富含杆状蛋白的中间丝构成。足突的细胞骨架由富含F-肌动蛋白的微丝构成，微丝形成环状束呈纵向排列；环状束之间由密集的辅肌动蛋白连接，在足突与主突的移行处，环状束弯曲与主突的微丝及微管相连，这样的结构特性使足细胞具有对抗肾小囊内张力的能力[8]。

3.1.1 CD2AP与肌动蛋白：足细胞的分化伴随着细胞骨架的重排和细胞形态的变化。而CD2AP在足细胞分化中起重要作用[9]。Lehtonen等[10]发现，CD2AP和F-肌动蛋白在体外培养小鼠肾皮质集合管细胞中存在部分共定位现象，肌动蛋白细胞骨架的破坏可导致内源性CD2AP解体，考虑这种相互作用是通过CD2AP的COOH末端介导的。He等[11]发现，白蛋白过载可引起永生化小鼠足细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的p17亚基表达上调、F-肌动蛋白细胞骨架破坏及CD2AP表达降低，从而引起足细胞启动凋亡程序；而用CD2AP真核表达载体转染这些细胞后可逆转上述改变，考虑CD2AP可能参与抑制促凋亡的转化生长因子β信号传导以维持足细胞稳态。Zhao等[12]也发现，在增强肌动蛋白加帽蛋白和肌动蛋白结合蛋白促进Arp2/3复合物介导的肌动蛋白组装的能力方面，CD2AP起着关键的支架作用。由此可见，CD2AP可从多个方面影响肌动蛋白细胞骨架，CD2AP异常表达及分布均导致其稳定性的破坏，而这可引起蛋白尿的发生。

3.1.2 CD2AP与F-肌动蛋白结合蛋白：目前已发现F-肌动蛋白结合蛋白有α-辅肌动蛋白-4、突触足蛋白、结蛋白、波形蛋白和巢蛋白等。(1)α-辅肌动蛋白-4连接F-肌动蛋白，具有调节足细胞机械动力的作用[13]。在α-辅肌动蛋白-4缺陷小鼠中可观察到其足细胞与裂孔隔膜结合差，易引起足细胞之间分离，从而导致足细胞损伤[14]。由此可见，作为裂孔隔膜特异性表达的蛋白，CD2AP与α-辅肌动蛋白-4有着密切的空间关联。(2)突触足蛋白可介导包含α-辅肌动蛋白-4和β-连环蛋白的复合物的形成，并与肌球蛋白Ⅱ相互作用，从而参与调节足细胞的运动功能[15]。Huber等[16]发现CD2AP和突触足蛋白可以直接相互作用，推断这种相互作用是由CD2AP的SH3结构域与富含脯氨酸的突触足蛋白片段结合而实现的，其中至少有2种不同的富含脯氨酸的片段可以与CD2AP结合。突触足蛋白是α-辅肌动蛋白-4的张力敏感调节剂，而敲除犬肾细胞MDCK细胞中的突触足蛋白可导致α-辅肌动蛋白-4和F-肌动蛋白在细胞连接处的积聚急剧减少，引起Venus-α-辅肌动蛋白在成熟单层滤过屏障中从细胞连接处重新定位到细胞质中[15]。由此推测CD2AP和突触足蛋白同时也存在间接作用。(3)结蛋白是一种细胞骨架中间丝蛋白，与其他蛋白共同构建细胞骨架结构。正常情况下，结蛋白在足细胞中不表达，当足细胞受到损伤时，结蛋白表达升高以应对损害。Wang等[17]在表现为大量蛋白尿的阿霉素肾病大鼠中发现，肾小球足细胞裂隙膜蛋白(podocin)、肾病蛋白(nephrin)等裂隙隔膜蛋白的表达下调，而CD2AP和中间丝蛋白-结蛋白的表达上调。但目前CD2AP与结蛋白之间的具体作用尚未确定。(4)目前尚未有研究证实波形蛋白、巢蛋白与CD2AP有直接作用关系。综上，CD2AP可通过调节相关F-肌动蛋白结合蛋白来影响细胞骨架，从而对维持细胞骨架结构、保证正常滤过功能具有重要作用。

3.2 CD2AP与裂孔隔膜蛋白之间的相互作用 肾小球裂孔隔膜作为选择性屏障，可防止大分子过滤到超滤液中，并受到来自肾小球滤液流动所引起的剪切应力的影响。裂孔隔膜蛋白包含了在黏附和紧密连接处表达的蛋白，如P-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、闭塞小带-1、轴突蛋白、受体酪氨酸激酶亚家族Eph的配体B1、紧密连接蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、闭合蛋白、钙/钙调素依赖性丝氨酸蛋白激酶、连接黏附分子、膜相关鸟苷酸激酶转化蛋白2和钙黏蛋白等，以及足细胞特有的蛋白，如受体酪氨酸激酶亚家族Eph的配体(nephrin)、podocin、NEPH和CD2AP等[18-19]。

podocin可将nephrin和CD2AP募集到裂孔隔膜上，然后通过其COOH末端与CD2AP和nephrin结合，从而形成nephrin-podocin-CD2AP复合物，嵌入脂筏中[20-21]。podocin、nephrin、CD2AP之间存在相互作用：nephrin也是一种信号分子，而podocin可显著增强nephrin诱导的信号传导，从而激活丝裂原活化蛋白激酶[22]；nephrin和CD2AP在体内与磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)的p85调节亚基相互作用，将PI3K募集到质膜，并与podocin一起刺激足细胞中依赖PI3K的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号传导，而PI3K/Akt信号的激活是维持足细胞功能完整性的重要组成部分[23]。有研究表明，Akt活性较低的大鼠肾小球上皮细胞合成的应力纤维较多，上调Akt活性后，这些细胞的应力纤维合成减少，而应力纤维影响着肌动蛋白骨架的分布[24]。由此推测，nephrin-CD2AP-PI3K/Akt复合物参与调节足细胞的肌动蛋白细胞骨架。

钙黏蛋白是一组钙依赖性黏附分子，参与着细胞与细胞之间的黏附。足细胞的裂隙隔膜是一种特殊的黏附结构，含有几种支架蛋白，包括P-钙黏蛋白、CD2AP和FAT蛋白[25]。 Tang等[26]通过蛋白质印迹检测发现，在敲除CD2AP基因的MDCK细胞系中，E-钙黏蛋白水平没有发生显著变化；但用单个解卷积光学图像比较E-钙黏蛋白、CD2AP和F-肌动蛋白的连接强度，发现E-钙黏蛋白与CD2AP水平存在中等相关性，E-钙黏蛋白在敲除CD2AP基因的MDCK细胞上分布减少。但目前尚未明确CD2AP与P-钙黏蛋白、FAT钙黏蛋白相互作用。

ephrin-B1在裂隙隔膜处表达，参与维持裂隙隔膜分子的正确排列和裂隙隔膜的屏障功能[27]。Hashimoto等[28]发现ephrin-B1、nephrin和CD2AP在大鼠足细胞上存在共定位现象；用小干扰RNA靶向抑制这些细胞中的ephrin-B1表达，发现CD2AP仅在细胞核周围表达。该结果表明ephrin-B1有助于 CD2AP 在足细胞中的正确定位。但目前尚未有研究发现ephrin-B1与CD2AP存在直接的相互作用。

NEPH1、闭塞小带-1等蛋白协助维持着裂孔隔膜的屏障功能，目前尚无研究发现CD2AP与这些分子的直接作用。

3.3 CD2AP与基底膜区蛋白之间的相互作用 基底膜区蛋白在维持细胞正常形态、足突与基膜的相互作用以及足突的正常定位具有重要作用。整合蛋白α3β1是主要的足细胞基底膜区蛋白，其在足细胞中高度表达。整合蛋白α3β1等黏附复合物与基底膜上的层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白等蛋白相互连接，进而将基底膜与足细胞的肌动蛋白细胞骨架相联系，从而使足细胞牢固地锚定在基底膜上[29-30]。Karabulut等[2]对发生肾结石病变大鼠的足细胞进行免疫组化检测，发现这些细胞的CD2AP表达上调，而整合蛋白α3β1 表达下调。虽然目前尚未发现CD2AP与足细胞高度表达的整合蛋白α3β1之间存在直接相互作用，但这些基底区蛋白通过间接相互作用来影响着CD2AP的表达与分布。

3.4 CD2AP与顶膜区蛋白 由于足细胞标记蛋白(podocalyxin)、平足蛋白(podoplanin)、podoendin和肾小球上皮蛋白等顶膜区蛋白的存在，顶膜结构域带负电荷，可有效阻止白蛋白通过[18-19]。这些蛋白对于足细胞的功能具有重要意义。Refaeli等[31]通过敲除处于毛细血管袢末期小鼠足细胞的podocalyxin基因，并对这些细胞进行podocalyxin和podocin免疫荧光共染色，发现podocalyxin和podocin表达均减少，并且podocin已错误定位到足细胞细胞体的顶膜区，推测podocalyxin有助于裂隙隔膜相关蛋白podocin在细胞上正确定位。而由上文可知podocin通过其COOH末端与CD2AP与nephrin结合，因此推测podocalyxin可间接影响CD2AP。但目前暂无研究表明CD2AP与podocalyxin、podoplanin、podoendin和肾小球上皮蛋白这些分子之间存在直接相互作用。

3.5 CD2AP与离子通道相关蛋白 离子通道对维持正常足细胞功能至关重要，该通道的失调可能导致足细胞内外离子失衡，进而造成足细胞损伤。肾小球足细胞表达 瞬时受体电位阳离子通道亚家族C(transient receptor potential cation channel subfamily C,TRPC)1、TRPC3、TRPC4、TRPC5和TRPC6蛋白；使用电生理学和药理学方法进行分析发现，目前只有TRPC3、TRPC5和TRPC6被证明有助于钙进入足细胞[32]。Reiser等[33]通过共定位研究发现，TRPC6与裂隙隔膜蛋白nephrin、podocin和CD2AP 相关；免疫印迹检测结果显示TRPC6仅与nephrin和podocin有直接相互作用，而不是 CD2AP。另外，目前也尚未发现TRPC3、TRPC5与CD2AP有存在着直接或间接相互作用。

4 小 结

足细胞结构的完整性是维持肾小球正常滤过功能的基础。这些结构的异常均会导致足细胞的结构异常，最终引起蛋白尿的产生。CD2AP与细胞骨架蛋白、裂隙隔膜蛋白、基底膜区蛋白、离子通道蛋白存在相互作用，这种相互作用是足细胞维持结构与功能完整性的基础；而在病理条件下，CD2AP的表达和分布异常可以影响着细胞骨架、肌动蛋白结构的完整性，同时改变了裂隙隔膜的分子组成，间接影响着顶端膜的完整性。因此，从CD2AP角度进一步探讨足细胞分子间相互作用机制，为足细胞损伤的靶点治疗提供了全新的思路，将产生革命性变革，具有重大意义。