糖 尿 病 肾 病 动 物 模 型 的 研 究 进 展▲

刘丹宁 黄国东 杨鑫勇

(广西中医药大学附属国际壮医医院1 肾病科,2 脑病科，广西南宁市 530000)

【提要】 糖尿病肾病是糖尿病严重且常见的微血管并发症之一，目前仍缺乏有效的特异性治疗方法，且缺乏良好的实验动物模型，目前糖尿病肾病主要的造模方法有诱发性、自发性、转基因法等方法，还有结合中医理论而建立的病证结合模型法，常见病证包括气虚证、气阴两虚证、血瘀证、阳虚证等。中医药在治疗糖尿病肾病上具有独特优势，但其机制机理目前尚不十分明确，因此研发理想的糖尿病肾病动物模型对于研究糖尿病肾病的病因、发病机制、干预措施，以及防治终末期肾脏病具有重要意义。本文对近年来国内外关于糖尿病肾病模型动物的选择、造模方法及模型成功的判定指标进行综述。

糖尿病是由于胰岛素分泌相对或绝对不足、靶细胞胰岛素敏感性下降或胰岛自身结构缺陷而导致代谢紊乱的慢性疾病[1-2]。持续性高血糖、胰岛素抵抗和脂代谢紊乱可导致糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病(diabetes nephropathy,DN)、糖尿病足和周围神经病变等一系列并发症，DN是糖尿病严重且常见的微血管并发症之一，也是终末期肾病和肾衰竭的主要原因之一，全球疾病负担调查结果显示，2017年全球糖尿病患者人数约为4.51亿，预计到2045年还将增加2.42亿，男性和女性DN的年龄标准化患病率分别为15.48/1 000和16.50/1 000[3-4]。目前对DN的治疗尚缺乏特异性的、有效的方法。中医学并无 DN 之病名，多将其列入“消渴”“水肿”“胀满”等的范畴。而随着中医药在治疗DN上的优势愈发突出，建立良好的病证结合的DN实验动物模型对于研究中医药治疗DN的机制，以及推动中医及中西医结合治疗DN的方药、药理的研究进展具有重要意义。理想情况下，病证结合的DN实验动物模型应具有与人类相似的临床状态特征，并且能够在整个稳定的慢性病理生理进化过程中检测血流动力学和生化参数的变化。然而，虽然有关建立病证结合的DN动物模型的研究取得了重大进展，但现有的病证结合的DN动物模型仍不能完全反映人类DN的病理和病理生理变化[5]。本文就近年来国内外关于DN实验动物模型的选择、造模方法及建模成功的判定指标进行综述。

1 DN实验动物模型

目前DN的发病机制还不完全明确，理想的DN动物模型不仅要能模拟DN的发生、发展,而且对药物的反应也需要与人类相似。目前，DN动物模型的构建方法主要包括诱发性、自发性、转基因法三类方法，自发性及转基因实验动物模型来源有限，价格昂贵，对饲养和繁殖条件要求较高，因此，药物诱发性DN动物模型是目前最常用的造模方法。

1.1 实验动物的选择

1.1.1 DN小鼠模型：自20世纪80年代以来，随着小鼠胚胎干细胞技术和基因敲除技术的出现，使得小鼠逐渐取代大鼠成为医学实验中建立DN模型最常用的动物。最新研究表明，将C57BL/6J小鼠的瘦素受体基因敲除后可得到db/db小鼠模型，单侧肾切除术后的db/db小鼠模型表现出早期DN的临床特征，可以用于DN病情初期进展机制的研究[6-7]。

非肥胖糖尿病(non-obesity diabetes，NOD)小鼠模型是目前最常用的1型糖尿病自发性模型[8]。C57BL/6J小鼠是研究DN最常用的品系，许多自发性DN小鼠都是由该品系基因突变而成的。有学者发现，与C57BL/6J小鼠相比，从高脂饮食喂养的第4周开始，KK-Ay小鼠的脂质代谢指标(总胆固醇、三酰甘油、LDL-C)水平明显高于C57BL/6J小鼠，两组的差异在高脂饮食喂养第12周时最显著，而在高脂饮食喂养的第16周后，KK-Ay小鼠脂质代谢指标(总胆固醇、三酰甘油)水平仍明显高于C57BL/6J小鼠[1]。有学者在糖尿病db/db小鼠与C57BL/KsJ小鼠的基础上研究出一种具有内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)完全遗传缺陷的小鼠系,这种新型的eNOS-/-db/db C57BL/KsJ小鼠表现出的高血压、尿白蛋白等症状较KK-Ay小鼠更为明显,同时出现广泛的肾小球系膜基质扩张、肾小球膜炎、肾小球基膜增厚、小动脉透明变性和肾小管间质纤维化等与人类DN相似的病理表现。研究表明，与链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导的空腹血糖升高或仅胰岛素抵抗的SD大鼠相比，空腹血糖和胰岛素抵抗性均较高的KK-Ay小鼠更容易发展为DN，KK-Ay小鼠模型更能表现出与2型糖尿病相关的典型病理特征，其早期表现和肾脏病变更明显[1]。

在DN疾病进展过程中，DN合并高血压是DN是发展为终末期肾病的主要危险因素，由于DN动物模型晚期没有高血压表现，缺乏存在肾脏病理变化的DN合并高血压小鼠模型是研发DN新治疗方法的一个重大障碍。

1.1.2 DN大鼠模型：研究表明，相比于小鼠，大鼠在认知行为等方面与人类的相似度更高。与小鼠相比，大鼠体型较大，其生理学特征易于观察，是多种疾病的重要模型动物。DN大鼠造模品系以Wistar和SD为主,6～8周龄，体重在200～250 g之间[9]。生物繁殖大鼠和LEW.1AR1/Ztm-iddm大鼠是目前最常用的1型糖尿病自发性模型[8]。

农慧等[10]主张采用SD大鼠建立糖尿病模型,因为SD大鼠的免疫力强于Wistar大鼠。该团队研究发现采用相同剂量的STZ进行造模时,Wistar大鼠的死亡率可以达到50%以上，其原因可能是建模后Wistar大鼠的免疫力下降，因此对用于建立糖尿病模型的大鼠等级和饲养环境要求更高。为了研发新的DN大鼠模型，包括美国糖尿病并发症动物模型协会成员在内的一些研究人员一直在利用遗传育种等手段加重DN大鼠的病情，使DN大鼠模型的主要特征变得更加明显，如联合采用基因模型与高热量饮食获得的Zucker脂肪型/自发性高血压心力衰竭F1杂交(Zucker fatty/spontaneously hypertensive heart failure F1 hybrid，ZSF1)大鼠，是一种常见的糖尿病合并高血压和肥胖大鼠模型，该大鼠模型可出现高血压、高血糖、高脂血症和肾功能不全等表现，且ZSF1大鼠模型与其他DN啮齿动物模型相比，尤其是与DN小鼠模型相比，最大的区别是其出现显著的管间质纤维化[5]，这是人类DN的一个关键病理特征。

1.1.3 其他动物：鼠类、啮齿类动物模型并不能完全地反映DN患者的代谢背景与所有的病理改变，疾病的生理机制也不完全相同。因此，新西兰兔、斑马鱼、小型猪、斑马鱼等亦可作为研究DN的模型动物，且各自有其不可替代的优势。

DN新西兰兔模型较DN鼠类模型具有模型稳定、重复性好、抗病性强等优点，且方便进行反复采血、灌胃、静脉注射药物等操作，以及进行组织器官影像学检查[11]。与DN鼠类模型的造模方法不同，DN新西兰兔模型需禁食水12 h后,经耳缘静脉注射50 mg/kg四氧嘧啶,隔天禁食水12 h后再次经耳缘静脉注射100 mg/kg四氧嘧啶(均以注射用水配成5%浓度)，注药后48 h内给予自由摄取10%葡萄糖水[12],干预后12周，如新西兰兔肾小球毛细血管袢呈分叶状,基底膜及系膜基质增生，肾小管部分基底膜增厚,上皮细胞肿胀、颗粒变性，则提示DN模型成立[13]。但相较于DN鼠类模型，DN兔类模型成模率较低，造模过程中死亡率较高[14]，其肾脏形态学变化与DN患者对比未见典型肾小球结节，系膜基质增加及外周毛细血管渗出亦不明显[15]。

小型猪也是制备2型糖尿病模型的理想动物之一。不论在生理解剖结构、疾病发生机制，还是在糖脂代谢和血液生化指标上，小型猪与人类都有较高的相似度[16]。广西巴马小型猪是采用纯繁闭锁繁育及半同胞为主的近交方式进行选育而成的遗传纯和很高的近交群体的小型猪品系，蒋子健等[17]给予广西巴马小型猪高脂高糖饲料喂养，并多次经耳缘静脉注射小剂量(50 mg/kg)STZ，建立了较为理想的DN模型。相较于鼠类模型，小型猪模型在生理结构和代谢机制上更接近于人类，并且有足够的血液、尿液及肾脏等组织标本供实验检测，应用活检和内窥镜技术还可以监测肾脏组织的时序性改变，但其造模时间长，造模成本高，仅能模拟DN早期肾脏病变,尚未观察到肾小管间质纤维化和/或肾功能下降等进展期DN病变。

成年斑马鱼的葡萄糖代谢及在斑马鱼胚胎发育中的葡萄糖代谢情况与人类及其他哺乳动物非常相似，因此，成年斑马鱼是观察生理和糖尿病条件下器官发育、形态和功能的理想模型。研究表明，生理条件下斑马鱼的血糖水平在3.3 mmol/L左右，可以通过饲喂和空腹进行动态调节[18]。鼠类的高血糖诱导通常是通过单次注射高剂量或连续注射低剂量的STZ来实现的，可在数天或数周内引起高血糖，而在斑马鱼中，注射胰十二指肠同源异型基因1吗啡利诺诱导高血糖只需要2 d，并且在研究葡萄糖记忆效应机制及支持高吞吐量分析和筛选上，因其繁殖速度快、操作简便而具有独特的优势[18]。

1.2 造模方法 诱发性DN动物模型的建立原理是通过损伤动物的胰岛细胞,导致胰岛素缺乏从而引起实验性糖尿病或高血糖，进而引发DN。STZ对肝肾损害较小，可通过葡萄糖转运蛋白定向破坏胰岛β细胞，是近年来建立糖尿病动物模型的首选药物。

1.2.1 一次性注射大剂量STZ：一次性大剂量注射STZ诱导糖尿病大鼠模型的机制是STZ直接造成胰岛β细胞的损伤，因此通常认为该方法所建立的模型为1型糖尿病模型，然而不同种糖尿病动物模型所给予的STZ剂量各有不同，甚至对于同种动物一次性大剂量注射不同剂量的STZ所构建的模型也存在差异。一次性大剂量注射STZ建立DN 大鼠模型所需要STZ的剂量，目前国内外尚未统一，国内研究一般选取45～65 mg/kg[19-21]，而国外则采用70～100 mg/kg[22-24]。叶桐江等[25]研究发现，禁食20 h后一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg为建立1型糖尿病大鼠模型的最佳禁食时间和最优剂量。但农慧等[10]使用55mg/kg的大剂量STZ一次性注射SD大鼠进行造模，并将非空腹血糖水平≥13.8 mmol/L作为建模成功的标准，发现使用一次性注射55 mg/kg STZ的造模周期相对缩短。还有研究表明，单纯一次性大剂量注射STZ所建立的模型更接近1型糖尿病患者的代谢状态，而在大剂量注射STZ基础上联合烟酰胺腹腔注射，可以部分保护胰岛β细胞免受STZ诱导的损害，能更好地模拟2型糖尿病患者的代谢状态[26]。

1.2.2 高糖高脂饮食联合STZ注射：研究显示，高糖高脂饲料喂养的大鼠表现出与肥胖并前驱糖尿病具有相同的代谢表型，即葡萄糖耐量和胰岛素敏感性受损，以及高三酰甘油血症和脂质过氧化作用；尽管肌酐水平没有变化，但前驱糖尿病动物仍表现出肾小球月牙样病变，并伴有肾脏组织油红-O染色脂质沉积率增加，三酰甘油、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA表达升高[27]。研究发现，高脂高糖饲料(10%猪油+ 20%蔗糖+ 2.5%胆固醇+ 1%胆酸盐+ 66.5%常规饲料)联合STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型的STZ最佳剂量为35 mg/kg，建模成功率高且死亡率低，模型稳定；多次注射STZ可激活大鼠免疫系统,诱导胰岛的免疫反应,引发胰岛炎,该方法所建立的模型被认为是更接近于2型糖尿病患者的动物模型[1，28-29]。有研究显示，高热量饮食联合一次性腹腔注射高剂量(60 mg/kg)STZ诱导4周龄雄性大鼠可建立1型糖尿病和晚期2型糖尿病模型，而高热量饮食联合一次性腹腔注射低剂量(30 mg/kg)STZ 诱导4周龄雄性大鼠能更快地形成具有胰岛素抵抗的早中期2型糖尿病模型，并能提高成模率[30]。

1.2.3 手术联合一次性注射STZ：有学者在大鼠耳朵尾巴连线与右肋弓的交界点做一长约1 cm的横行切口，逐层分离皮肤、黏膜、肌肉，充分暴露右肾后再将其切除，检查无出血后逐层缝合；术后1周，大鼠禁食不禁水12 h，按40 mg/kg一次性腹腔注射10 mg/mL STZ，建立DN模型，这种方法相对于单纯注射STZ，可以显著缩短造模周期，而相较于三联法(手术+高糖高脂饮食+小剂量STZ)则操作较简单，成本较低， DN大鼠模型稳定，且无自愈现象[6,31-32]。

1.2.4 手术+高糖高脂饮食+小剂量注射STZ：单侧肾动脉结扎+高糖高脂饲料喂养+小剂量STZ(30～45 mg/kg)腹腔注射的三联法是目前应用最广泛的诱发性DN动物模型的制备方法，一般只需要干预3 d即可造模成功，此时可观察到DN早期的临床特征及病理表现，建模9周后进入DN中期，建模22 周后进入DN晚期[33]。此三联法虽然造模时间较短，具有显著的生化和病理改变，但是存在操作复杂、易感染、死亡率高等缺点，对研究者的实验操作水平要求较高。

2 病证结合DN模型

DN在中医中并无特定的名称，一般多将其归于“消渴”“水肿”“胀满”等的范畴，其作为糖尿病的后期并发症，病程长，多属本虚标实证。《素问·通评虚实论》中提出消瘅、仆击、偏枯、痿厥等类似糖尿病并发症的描述，并指出上述疾病发生的病机为“隔塞闭绝，上下不通”。“肾消”一词首见于《古今录验方》，《三因极一病证方论》提及消肾的病位在肾，病机为纵欲过度，肾精不足，又多食丹药，内热从生，石气孤立，导致精溢自泄、唇口干焦、不饮自利，认为消肾的病机为热伏于下，肾精亏虚。《景岳全书》提到“下消者，……为淋为浊，如膏如脂，……其病在肾，故又名肾消也”，提出肾消的病机为火热内生、消灼肾阴或阴虚火旺，同时也提出阳虚亦可致消的观点。由此可知，气阴两虚证是糖尿病并发症证型中最常见的证型，而血瘀证始终贯穿糖尿病的整个病程。病证结合DN模型的建立主要是在建立DN模型的基础上模拟中医证型的造模方法。

2.1 气虚证 樊少仪等[34]根据临床上部分糖尿病患者由于疲劳和饮食失节导致DN的发生或进一步加重的原理，采用疲劳联合饥饱失常法建立气虚证DN模型，将DN成模的大鼠连续14 d放入水温为(43.0±0.5) ℃ 、水深为35 cm的恒温水槽中游泳，每天以每只大鼠出现自然沉降的时间为其游泳耐疲劳的时间，当50%的大鼠出现自然沉降时停止游泳。DN气虚证大鼠模型建模成功的标准：疲劳游泳后测量游泳持续时间及悬挂时间，游泳持续时间及悬挂时间缩短30%以上，大鼠出现明显精神倦怠，懒动，自发活动减少，皮毛蓬乱无光泽、眼眯成线和缩肩拱背，粪便稀溏，随着时间的延长，上述症状逐渐加重。

2.2 气阴两虚证 李诗[35]采用高糖高脂饲料+腹腔注射STZ的方法建立DN大鼠模型，然后采用具有耗气破气功效的中药颗粒剂(附子10 g、青皮15 g)药液，根据大鼠体重按15.75 g/(kg·d)连续灌胃给药4周，4周后大鼠出现明显的倦怠乏力懒动、嗜蜷卧、善惊恐打斗、被毛色黄晦暗无光、舌胖大少津、舌面光滑无苔等表现，视为气阴两虚型DN大鼠模型建模成功。胡正远[36]采用三联法(手术+高糖高脂饮食+小剂量STZ腹腔注射)制备DN大鼠模型，成模后以中药干姜、肉桂、青皮依照1 ∶1 ∶1的质量比例，煎剂浓度为1 g/mL，按体重15 g/(kg·d)连续灌胃4周后DN大鼠出现倦怠乏力懒动、毛发枯黄刺立、舌质紫红少津等症状。李进[37]采用高糖高脂饲料+一次性腹腔注射STZ的方法建立DN大鼠模型后，连续灌胃耗气伤阴颗粒中药煎剂的同时附加睡眠剥夺导致大鼠出现紧张、焦虑、劳累、惊恐等表现，共干预4周，成功建立气阴两虚证DN大鼠模型。陈群等[38]采用高脂喂养+小剂量STZ建立DN模型大鼠，采用低温调控手段诱导血瘀证模型大鼠后，再从中筛选出同时具有气阴两虚证的大鼠，并予糖脉康颗粒(临床治疗气阴两虚夹瘀证糖尿病的经典方药)反证动物模型，以此得到较为满意的气阴两虚夹瘀证的DN大鼠模型。

2.3 血瘀证 庞欣欣等[39]采用一次性大剂量腹腔注射STZ建立DN大鼠模型8周后，筛选24 h尿蛋白含量≥40 mg的DN大鼠给予尾静脉注射 10%大分子右旋糖酐，共3次，第 1 次尾静脉注射后间隔 5 h 后进行第 2 次注射，然后禁食，次日尾静脉注射第 3 次，2周后大鼠均有皮毛和唇色泽暗淡，眼球暗红，耳郭及舌下脉络颜色紫红、紫暗明显，爪掌水肿，颜色偏暗等血瘀证表现。还有学者将成模的糖尿病大鼠在16 ℃下饲养4周，以此得到气阴两虚夹瘀证DN大鼠模型[36]。

2.4 阳虚型 孙红旭等[40]采用高糖高脂饲料+2次小剂量腹腔注射STZ建立DN大鼠模型后，选取造模成功的大鼠并给予腺嘌呤及苦寒中药(龙胆草、栀子、番泻叶)混合灌胃，得到肾阳虚型DN大鼠模型。李海霖等[41]结合高原地区的地理因素，让大鼠每日在气压减至相当于海拔5 000 m的真空舱内活动3.5 h，随后放入冰箱冷藏室中，对大鼠进行寒冷刺激3.5 h，共干预35 d，同时按50 mg/kg给予一次性腹腔注射STZ，以此来建立高原阳虚血瘀型DN大鼠模型。

3 DN动物模型成模的标准

既往研究表明，糖尿病大鼠于第8周开始出现肾病蛋白表达异常并逐渐加重， 而肾病蛋白被认为是糖尿病肾损伤早期的标记物[42]。周淑红等[43]研究发现，在成模后第16周时糖尿病大鼠模型才出现肾脏肥大、高滤过和肾小球基质增生，且尿素氮、血肌酐和肾小球滤过率与DN发生均无相关性，这提示在DN早期检测尿白蛋白水平并不能完全反映肾脏病理损害变化。

目前糖尿病与DN动物模型成模的标准尚未统一，不同研究的成模标准均不同。常用的糖尿病动物模型成模标准为：注射STZ或者四氧嘧啶等造模药物72 h后，连续3 d采集尾静脉血检测血糖,至少连续3次血糖水平≥16.7 mmol/L，尿糖强阳性[25,42，44]，口服葡萄糖耐量试验后血糖水平≥11.1 mmol/L[30,45]，24 h尿量多于空白对照组的50%[31]。DN早期的典型特征是肾小球肥厚，肾小球系膜基质中度扩张，肾小球毛细血管壁增厚；随着病情的发展,肾小球硬化症是DN的主要病理学特征，表现为肾小球基底膜增厚，系膜细胞和足细胞损失扩张[3,40]。 基于此，美国糖尿病并发症动物模型协会制定了DN啮齿动物模型的验证标准:(1)DN动物模型的整个生存期肾小球滤过率下降50%以上；(2)与相同品系、性别、年龄的对照组相比，尿蛋白增幅超过10倍；(3)肾脏系膜基质增生伴或不伴结节硬化和系膜溶解，基底膜增厚超过基线水平的50%，小动脉透明样变，小管间质纤维化[46]。

4 小结与展望

目前，鼠类模型仍是大多数研究者构建DN实验动物模型的第一选择，最常使用的是STZ联合高糖高脂饲料或三联法(高能量饮食+STZ注射+单侧或部分肾切除)构建DN鼠类模型，其中db/db小鼠[(30.0±2.5)g]和Wistar大鼠、SD大鼠[(225±25)g]是使用最多的动物，通常使用化学药物四氧嘧啶或STZ诱导动物糖尿病发病，四氧嘧啶通过选择性破坏胰岛β细胞，使胰岛素分泌不足引起血糖升高，但其在早期可造成肝、肾组织中毒性损害；而STZ对肝肾损害较小，可通过葡萄糖转运蛋白定向破坏胰岛β细胞，是目前应该最广的造模药物。但是，不论是四氧嘧啶还是STZ，都存在小剂量无效、大剂量致死的问题，用药剂量是影响造模成功的关键因素，而不同的研究者使用的剂量各有不同。同时，大多数动物模型，尤其是小鼠模型，尽管存在蛋白尿/蛋白尿和肾小球病变，但不表现为小管间质纤维化，也不发展为进行性肾功能衰竭。因此，仍然需要进一步研究建模的给药剂量和规范的DN成模标准。

近年来，中医病证结合DN动物模型的研究报告仍较少，主要是在DN成模的基础上，通过动物的皮毛、唇、眼球、耳郭、舌下脉络、爪掌、尾根颜色等筛查出目标证型，或者予相关证型特点的中药汤剂灌胃造模，或者根据证型的血流动力学特点注射相关药物以模拟证型特点。研究更恰当、更准确的病证结合DN动物模型，寻求构建与人类肾脏解剖和生理特征相似特征的动物模型，以求能够攻破DN发病机制的难点及寻求更好的防治方法，已经成未来DN动物模型研究发展的必然趋势。