慢传输型便秘动物模型构建方法的研究进展▲

范明明 林 伟 韩海瑞 张嘉裕 王 顺

(黑龙江省中医药科学院,黑龙江省哈尔滨市 150000)

【提要】 慢传输型便秘是一种常见的功能性便秘，肠道传输功能受阻、肠内容物阻滞、传输时间延长为其疾病特点，其发病机理目前尚未完全明确，需要借助稳定可靠的动物模型进行深入研究。近年来有学者通过单因素、双因素、复合因素等方法成功制备大鼠、小鼠等慢传输型便秘动物模型。本文对近年来慢传输型便秘动物模型的常用构建方法的相关研究进行综述。

功能性便秘是一类需要排除器质性肠道病变、全身系统性疾病及药物引起继发性便秘的常见功能性肠病，临床表现以排便困难、排便不畅、排便时间延长或排便次数减少为主，且不满足肠易激综合征的诊断标准。临床上功能性便秘可分为慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)、出口梗阻型便秘和混合型便秘。STC是功能性便秘中发病率较高的便秘类型，又称结肠无力[1]，主要以结肠蠕动能力减弱、传输能力下降、传导时间延长为特点[2]；临床表现主要有排便显著困难、排便次数明显减少、便意感减弱或消失伴腹胀、病情反复发作等[3]。流行病学调查显示，我国功能性便秘患病率约为3.8%[4]，STC患者占功能性便秘患者的 45.5%[5]。目前，STC 的病理生理机制尚未完全清楚，治疗方法尚未形成统一标准，且疗效欠佳，患者病情易反复，可不同程度地降低患者的生活质量。有研究表明，STC患病率随年龄的增长而升高[6]，轻者伴有焦虑、抑郁等症状[7]，重者常可出现急性肠梗阻、肠坏死穿孔、心脑血管疾病等[8]，该病已经成为严重影响人们日常生活的消化系统疾病之一。

根据STC的临床特点，中医学将其归属为“便秘”。《素问》云“大肠者，传道之官，变化出焉”，饮食入胃，经脾胃运化、小肠泌别清浊，糟粕下输大肠而形成大便。若平日喜食辛辣、酒及厚味，日久肠胃积热,伤津耗气；平素情志抑郁善叹息，久则气机郁滞，大肠传导无力；素体虚弱，或病后、产后及年老体虚之人，阴虚内燥，血虚不润，阳虚不煦，肠道濡养温煦不足，日久大便艰涩难下[9]。该病病位在大肠，与肺肝脾肾密切相关。中医药治疗STC具有耐受性好、疗效可靠、副作用小等优点。为明确中医药治疗STC的机制，需要运用西药联合中医证候因素建立稳定可靠的中医证候STC模型。本文分别从西医、中医的角度对近年来采用单因素、双因素、复合因素等方法建立STC模型的研究进展进行综述。

1 单因素造模方法

1.1 洛哌丁胺法 外周阿片受体激动剂洛哌丁胺可减慢胃肠蠕动，延长肠内容物排出时间，上调大鼠结肠黏膜水通道蛋白4、水通道蛋白8的表达水平，促进肠腔内水的吸收，且不易透过血脑屏障而无明显抑制中枢神经系统的作用。郑舒泽等[10]以浓度为0.6 mg/mL的盐酸洛哌丁胺按10 mL/(kg·d)的剂量给予小鼠灌胃，2次/d，连续给药7 d后，小鼠出现首粒黑便排出时间延长、排便粒数减少等表现，小鼠结肠黏膜层上皮细胞破损或缺失，杯状细胞减少，固有层及黏膜下层轻度炎性细胞浸润，肌层明显变薄，提示造模成功。此法所建立的STC模型稳定可靠且安全，不易造成动物死亡。

1.2 复方地芬诺酯或复方苯乙哌啶法 复方地芬诺酯与复方苯乙哌啶均由盐酸地芬诺酯和硫酸阿托品按比例混合而成,可兴奋胃肠道平滑肌,减弱结肠蠕动,延迟肠内粪便排出,促进肠内水吸收,减少腺体分泌,起到止泻作用,且可导致便秘[11]。万叶敏等[12]将雌雄大鼠分笼适应性饲养7 d后，给予大鼠自由饮水的同时，给予含有复方苯乙哌啶的饲料按8 mg/(kg·d)饲养,连续喂养120 d,制备STC模型，每隔5 d记录大鼠粪便粒数及含水量、大鼠体重；造模结束后，大鼠精神萎靡，活动减少，皮毛枯槁少光泽，进食及饮水量减少，体重增长缓慢或停止增长，粪便粒数明显减少，粪便小而干硬伴有黑便，提示造模成功。采用此法制备STC模型，耗时周期较长，但模型稳定，不易反复。

1.3 吗啡法 阿片类药物作用于胃肠μ受体是产生阿片类药物相关便秘的重要原因[13]。吗啡与胃肠μ受体结合阻碍乙酰胆碱的释放，进而使肠道平滑肌收缩功能减弱，并使各种消化液的分泌受到抑制,肠道对水的吸收增加,肛门括约肌收缩增强导致便秘[14]。许海尘等[15]对适应性喂养3 d的小鼠给予2.5 mg/(kg·d)的盐酸吗啡皮下注射，连续注射45 d，以小鼠平均每日粪便重量减轻、肠道推进率下降作为STC模型制备成功的判断标准。此方法较为常用，但吗啡有明显的呼吸抑制作用，具有一定的安全隐患。

1.4 泻剂结肠法 大黄水煎剂中的结合型蒽醌苷是大黄泻下机制中的主要成分，可被大肠中的细菌酶水解为游离型大黄酸蒽醌和大黄酸[16]，长期服用大黄等泻剂可导致结肠神经系统紊乱和相应的功能缺失，对泻剂的反应性降低，阻碍结肠蠕动功能，形成“泻剂结肠”[17]，其是STC的一种重要类型。黄伟等[18]采用含大黄素的饲料喂养小鼠,以100 mg/(kg·d)为初始剂量，随后每日剂量增加1倍,增至800 mg/(kg·d)时约一半的小鼠出现稀便,然后维持此剂量至稀便完全消失；再以1 600 mg/(kg·d)为起始剂量,日增1倍，最终剂量为6 400 mg/(kg·d)并循环3次，整个疗程共82 d，成功建立STC模型。贡钰霞等[19]对黄伟等[18]的STC造模方法进行改良，以浓度为20 mg/mL的大黄酸液给予大鼠灌胃，第1循环给予12 mL/kg大黄酸液灌胃，隔日1次，直至80%的大鼠稀便消失；第2循环灌喂5 d停2 d，剂量及用法同第1循环，直至80%的大鼠稀便消失；第3循环再给予16 mL/kg大黄酸液灌胃，灌喂5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失。第3循环结束后给予16 mL/kg大黄酸液持续灌胃 1 周，以肠道推进率降低作为STC大鼠造模成功的标准。上述研究结果表明，大黄灌胃制备STC模型具有简便易行、模型稳定等优点，且大黄价格低廉、来源广，便于获取。然而，相较于大黄酸制备STC模型，大黄灌胃的剂量不确定性较大，造模后期易导致动物出现水电解质紊乱、免疫力下降等[20]。目前，对于采用大黄水煎剂或大黄酸灌胃构建的STC动物模型的灌胃剂量、灌胃阶段、各阶段持续时间等尚未达成共识。

1.5 冰水灌胃法 有研究报告，冰冷盐水刺激可导致小鼠空肠、回肠和近端结肠肌层神经丛的肠神经系统发生变化，根据该原理制作的动物便秘模型，即使终止冰水刺激后，亦具有一定的稳定性[21]。此外，5-羟色胺4受体可以促进豚鼠回肠平滑肌松弛，冷水刺激后胃肠平滑肌细胞内一氧化氮含量增加，进而上调5-羟色胺表达减缓肠的蠕动[22]。林强等[23]采用0 ℃～4 ℃的生理盐水给予大鼠灌胃，2 mL/次， 1次/d，连续14 d，构建STC大鼠模型，以大鼠结肠纵行肌收缩幅度、频率下降和结肠推进率降低作为建模成功的标准。该方法建立的STC大鼠模型出现皮毛枯槁、畏寒少动、神情呆滞等症状，与中医阳虚证基本相符。冰水造模简便易行，但实验周期较长且模型不稳定，故在中医药治疗STC的研究中已较少采用。

2 双因素造模方法

2.1 吗啡法+耗气伤津法 吗啡皮下注射可以阻碍乙酰胆碱的释放，从而抑制胃肠道平滑肌细胞收缩。林仁敬等[24]先给予大鼠皮下注射2.5 mg/kg 的盐酸吗啡，1次/d，连续注射45 d，同时在皮下注射盐酸吗啡15 d后，给予配方颗粒(组方为青皮、枳壳、附子)按13.0 g/kg灌胃，1次/d，连续灌胃30 d，以制备STC模型。造模结束后，大鼠表现出少动、皮毛枯黄无光泽、舌质淡略胖大、少津、排便次数减少、颗粒粗大且硬等情况，解剖见结肠中粪便呈串珠状或球状，质地干硬，提示成功建立气阴两虚型STC模型。造模所用的配方颗粒组方中的青皮、枳壳可破气耗气，且附子可燥热伤阴，长期服用易伤津耗气，采用该法建立STC模型符合气阴两伤的临床表现。

2.2 复方地芬诺酯+白醋法 中医有“味过于酸,脾气乃绝”及“欲令脾实,食勿太酸”等理论，过食酸味，易致脾虚则水湿不运，易脾阳而致阳虚。复方地芬诺酯中的盐酸地芬诺酯可直接作用于肠平滑肌，消除局部黏膜的蠕动反射进而减弱肠蠕动，同时增加肠的节段性收缩并促进肠道内水分吸收；而阿托品可减慢肠道蠕动，抑制肠液分泌。霍黎生等[25]将大鼠适应性饲养6 d后，于造模前1 d禁食不禁水24 h。造模期间，上午先给予2.0 mg/100 g复方地芬诺酯灌胃,间隔6 h后给予1.0 mL/100 g的山西白醋灌胃，1次/d，连续15 d，制备大鼠STC模型。以大鼠体重下降、大便粒数减少及含水量降低、小肠推进率下降为建模成功的判断标准；结果显示造模结束后,大鼠出现皮毛枯槁且少光泽、活动减少、倦怠嗜卧、反应迟钝、 食少 、消瘦的症状，符合中医阳虚表现。采用该法建立的STC模型具有复制简单、实用、经济、稳定等优点。

2.3 盐酸洛哌丁胺+氢化可的松法 盐酸洛哌丁胺可抑制肠道蠕动，促进肠道内水分吸收，进而导致便秘。糖皮质激素通过抑制下丘脑-垂体-靶腺轴，进而抑制促肾上腺皮质激素的释放，从而使大鼠出现畏寒肢冷、精神不振、被毛疏松少光泽等症状[26]。白克运等[27]给予大鼠3.0 mg/kg洛哌丁胺悬液灌胃，并给予氢化可的松注射液25.0 mg/(kg·d) 后肢肌肉注射，连续21 d，以大鼠首粒黑便排出时间延长为阳虚型STC模型制备成功的判断标准。采取该法建立的STC模型符合中医学阳虚的临床表现，且所制备的阳虚型STC模型具有易于控制、成模时间短等优点。

2.4 复方地芬诺酯+自身粪便法 用小鼠自身粪便研磨后灌胃，可引起小鼠急性细菌性腹膜炎,造成肠道动力障碍而引起便秘，多用于胃肠积热型便秘的造模。复方地芬诺酯可抑制肠道蠕动收缩，促进肠内水分的吸收与抑制肠液分泌，进而导致便秘。郑丰杰等[28]取小鼠粪便少许加生理盐水制成0.1 g/L的混悬液，按1.0 mL/只对小鼠进行灌胃，1次/d，连续3 d；于第5～7天，再给予2.0 mg/kg的复方地芬诺酯灌胃，0.3 mL/只，1次/d，连续3 d，制备小鼠STC模型；造模后小鼠皮毛枯黄毛躁、无光泽，精神倦怠、活动减少、食少、粪便少而硬，表明STC造模成功。该胃肠积热制备法取材便捷、模型简单，但应注意动物自身粪便宜临用现配。

2.5 复方地芬诺酯+限水法 复方地芬诺酯中的盐酸地芬诺酯可抑制肠道收缩，促进肠内水分的吸收，而阿托品可抑制肠液分泌，减弱肠道蠕动进而导致便秘。因此，复方地芬诺酯可导致机体津液耗损，使胃肠失于濡润，“无水则舟难行”，大便艰涩难出。马雪巍等[29]采用10.0 mg/kg的复方地芬诺酯加4.0 mL生理盐水制成浓度为50%的复方地芬诺酯混悬液，并对大鼠进行限水处理，即给予正常饮水量的1/3，约10.0 mL/d；每日给予大鼠灌胃4次，第 1 次灌胃复方地芬诺酯混悬液3.0 mL，其余3次分别灌胃超纯水2.0 mL、3.0 mL、2.0 mL，连续灌胃7 d；造模后大鼠粪便干硬量少、呈褐色颗粒状，精神倦怠，活动明显减少，毛发枯槁少光泽，体质量增加不显著，提示津亏型STC模型制备成功。该建模方法限制水的摄入，使得脾胃无生化之源，津液匮乏，不能濡养机体，可导致机体出现口干、皮肤干燥、毛发枯槁、大便干燥量少等症状，基本符合中医学的津亏证型。限水法所制备的津亏型STC虽然具有操作简单、造模周期短的优势，但模型稳定性较差。

2.6 复方地芬诺酯+酒精擦拭尾部法 慢性失血，血不养神则精神疲惫、少动嗜睡，体质量缓慢增长，血不养发则皮毛枯槁，血为气之母，失血日久气血俱虚则鼻唇淡白，耳尾苍白而发凉。吕艳锋等[30]以1.875 mg/kg的复方地芬诺酯连续灌胃小鼠30 d，同时于灌胃首日下午，用 75%乙醇棉球擦拭小鼠尾部，待血管扩张充血后，剪去小鼠尾尖端0.25～0.30 cm，将尾伤口浸入37 ℃温水中，直至小鼠失血0.15～0.20 mL；每5 d放血1次，共放血6次，以首次黑便排出时间延长，精神萎靡，蜷缩，耳、鼻、唇、尾苍白为血虚证STC模型成功的标准。该血虚证动物模型虽可在短时间内制备完成，但不能观察动物舌脉象，其是否完全符合中医血虚证还需深入研究，且造模过程中难以控制失血量，易出现伤口感染等情况。

3 复合因素造模方法

饮食失节、脾失健运可影响小肠传导功能，津亏水少不能润泽肠道则出现食滞、便秘等症状；脾气不濡，精微不散，则毛发枯槁无泽，精神倦怠。夏旭婷等[31]以20.0 g/(kg·d)的番泻叶灌胃小鼠7 d，造成脾虚状态，其间小鼠正常饮食、饮水；第8天停用番泻叶，采用饮食失节方法维持脾虚状态，采取隔日给予低纤维饲料，生大米6 g，每日饮水1次(30 min)，持续8 d，制备脾虚证STC小鼠模型。造模后，小鼠出现精神疲惫，易怒，毛发疏松少光泽，部分拱背、脱肛，活动少，进食减少，排便次数减少，粪质干且少等表现，表明造模成功。番泻叶配合饮食失节制备脾虚型STC小鼠模型，切合中医久泄致虚、饮食不节伤脾胃致脾虚的理论，具有操作简单、可重复性强的优点，但番泻叶剂型的选择、造模总体时间等需进一步明确。

4 STC模型造模成功的判断方法

4.1 一般状态的观察 主要通过观察实验动物体质量、粪便性状、日排便量、粪便含水量等一般情况的改变，评估模型是否符合传输时间延长、大便干燥、排便困难等STC模型的特点。

4.2 结肠传输功能的测定 造模结束后，通过灌胃活性炭记录首粒黑便排出时间或计算碳末在结肠内推进长度，进而计算结肠推进率，如结肠传输功能减弱，与STC临床特点相符，则可判断为STC模型造模成功。

4.3 Cajal间质细胞的检测 Cajal间质细胞广泛分布于肠道黏膜下层、肌层，在肠神经系统与胃肠道间起桥梁作用，传递肠神经元的兴奋性和抑制性神经信号，调控胃肠道运动。病理学研究显示，STC患者乙状结肠壁内Cajal间质细胞数量显著减少，这可能是STC发生的重要机制[32]。造模结束后，对结肠标本进行染色,显微镜下观察Cajal间质细胞的数量变化及形态学变化,可以验证模型是否成功构建。

5 小 结

STC病因病机未明，目前缺乏特异性的治疗方法，患者症状反复。近年来，学者们通过多种方法复制便秘动物模型,但是符合STC特点的造模方法不多。大多数中医药实验研究通过单一药物(洛哌丁胺、复方地芬诺酯、吗啡、大黄等)或物理刺激(冰水)制备STC动物模型，缺少STC中医证型的复制因素；制备STC动物模型时，在药物剂型、药物剂量、给药途径、给药持续时间等方面缺少统一的标准；各种造模方法在模型稳定性、操作便捷性上存在一定差异，如何构建稳定性好、操作简单的动物模型有待进一步研究。