高效液相色谱法测定西咪替丁片中的有关物质和含量

刘振丽，徐 丽

驻马店市食品药品检验所食品药品检验科，河南 驻马店 463000

西咪替丁片属于H2 受体拮抗剂，具有较强的抑酸作用，是临床治疗胃酸过多、胃溃疡等胃部疾病的常用药物［1-2］。随着研究的深入发现，西咪替丁片还具有治疗病毒所致的哮喘、黏膜出血和抗癌等功效［3］。故准确检测西咪替丁片中的有关物质和含量对后续临床治疗具有积极意义。紫外-可见分光光度法是检测西咪替丁含量的重要方式，但难以检测西咪替丁片中的有关物质。高效液相色谱法（HPLC）为色谱法重要分支，具有灵敏度高、可靠性高等优点，以液体为流动相，借助高压输液系统，能够将不同极性单一溶剂或不同比例混合溶剂等流动相泵入色谱柱内，从而分离各种成分，并进入检测器检测，故被广泛应用于多种药物的测定中［4-5］。本研究分析高效液相色谱法测定西咪替丁片中的有关物质和含量，为临床用药提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 仪器与材料

（1）仪器。高效液相色谱仪（Agilent LC1260 型，美国安捷伦）；Hypersil C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；sartorius MSA225S 电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司产品）；PHS-3C 型酸度计（上海精密科技雷磁）；紫外灯254（上海科艺光学仪器厂）。（2）材料。西咪替丁片（一力制药股份有限公司，规格：0.2 g，国药准字：H44023079，批号：20191208）；西咪替丁对照品（中国食品药品检定研究院，纯度为99.8%，批号：20191115）。乙腈、甲醇（色谱纯）。过氧化氢、氢氧化钠、盐酸、己烷磺酸钠、磷酸（分析纯）。

1.2 方法与结果

1.2.1 色谱条件及系统适用性试验 以Kromasil C18 作为色谱柱，以甲醇—水—乙腈（250∶680∶70，每1 000 mL中含0.5 mL 磷酸和1.081 g 己烷磺酸钠） 作为流动相，检测波长为220 nm，流速1.0 mL/min，进样量调整为10 μL，以室温为柱温度。精密称取适量西咪替丁对照品，用流动相溶解、稀释制成每1 mL中含有100 μg西咪替丁的溶液，取10 mL，滴加0.2 mL 的3%过氧化氢，置入水浴中加热，时间为20 min，待其冷却，即可获得系统适用性试验溶液。取上述溶液10 μL，加入液相色谱仪实施检测，记录色谱图，按西咪替丁峰计算≥6 000为理论板数，与西咪替丁相邻有关物质峰和西咪替丁峰间的分离度≥6。

1.2.2 流动相优选 用240∶760 比例的甲醇—水（每1 000 mL 中含0.3 mL 磷酸和0.94 g 己烷磺酸钠）作为流动相测定时，前3 min 噪音值偏大，基线不易走稳，峰形拖尾、变钝，甚至有峰裂现象出现。当用200:760:40 比例的甲醇—水—乙腈（每1 000 mL 中含0.5 mL 磷酸和1.081 g己烷磺酸钠）作为流动相测定时，分离度变小，出峰时间变长，无峰裂和拖尾现象出现。用250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈（每1 000 mL 中含0.5 mL 磷酸和1.081 g 己烷磺酸钠）作为流动相测定时，峰形完美，峰形对称、变锐，无拖尾现象出现，可更好的分离有关物质中某些成分，最终以250∶680∶70 比例的甲醇—水—乙腈作为流动相。

1.2.3 测定方法 （1）含量测定。取20 片西咪替丁，研成细粉，取约200 mg 西咪替丁，加入量瓶（200 mL）中，滴加150 mL 盐酸，振摇，使其充分溶解，再使用盐酸稀释至刻度，充分混匀后，滤过，取10 mL 续滤液，用250:680:70比例的甲醇—水—乙腈稀释至100 mL，混匀后作为供试品溶液，取10 μL，根据1.2.1 色谱条件，加入高效液相色谱仪，对色谱图纪录。另外取适量西咪替丁对照品，加入之前获取的溶液，稀释呈等同于供试品溶液浓度，作为对照组溶液，测定方法同上。以峰面积计算含量，检测含量为RSD 为0.6%，标识量为99.7%。（2）有关物质测定。取之前获取的供试品溶液1 mL，加入刻度为200 mL量瓶中，滴加250∶680∶70 比例的甲醇—水—乙腈至刻度，充分混匀后作为对照溶液，取10 mL 加入高效液相色谱仪，对检测敏感度调节，确保主成分色谱峰的峰值高度为满量程的20%～25%。在两区10 μL对照溶液和10 μL供试品溶液，按照1.2.1色谱条件，加入高效液相色谱仪，对色谱图记录。若供试品溶液有有关物质峰显现，各有关物质峰的峰面积之和≤对照溶液主峰的面积，单个有关物质峰的峰面积≤对照溶液主峰面积的40%。

1.2.4 专属性试验 取配置好的对照品溶液50 mL，分为5 份，1 份用紫外灯（254 nm）照射1 d，2 份分别加入0.2 mL 的2 mol/L 盐酸溶液和0.2 mL 的2 mol/L 氢氧化钠，水浴加热20 min，待其冷却后加入氢氧化钠溶液1 mol/L和盐酸溶液1 mol/L，将pH值调节成中性。1份加入0.2 mL的3%过氧化氢溶液，水浴加热20 min后冷却，另外1份水浴加热3 h后冷却。量去上述处理后的溶液各10 μL，根据

1.2.1色谱条件，对降解产物实施试验。本色谱条件能满足有关物质检查的系统适用性要求：经氧化、酸、碱、光照、高温条件破坏的溶液的色谱图中均产生程度不一的有关物质峰，均与主成分峰分离良好。

1.2.5 线性回归试验 在100 mL 量瓶中加入0.012 32g 西咪替丁对照品，加入250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈溶解，稀释成对照品溶液，其含有123.2 μg/mL 西咪替丁，取上述对照液20 mL、15 mL、10 mL、5 mL、2 mL、1 mL，分别用上述流动相稀释、定容，获取7个梯度不一的溶液，范围4.928～123.2 μg/mL，各取10 μL，按照1.2.1色谱条件进样，对色谱图纪录。线性回归以峰面积A 对浓度C 作为条件检测，线性关系良好，r=0.999 8，Y =31.841 3X-3.877 30。

1.2.6 定量限、检测限试验 （1）定量限。精密称取适量西咪替丁对照品，加250∶680∶70 比例的甲醇—水—乙腈，稀释、溶解制成含5.136 μg/mL 西咪替丁的溶液，根据1.2.1 色谱条件取10 μL 进样，定量限为5 136 ng，结果（S/N）为10∶1。（2）检测限。精密称取适量西咪替丁对照品，加250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈，稀释、溶解制成含1.035 μg/mL 西咪替丁的溶液，根据1.2.1 色谱条件取10 μL 进样，对色谱图纪录，检测限为1 035 ng，结果（S/N）为2∶1。

1.2.7 系统精密度、溶液的稳定性试验 取10 mL 1.2.3下获取的对照品溶液，根据1.2.1 色谱条件实施6 次重复进样，对液相色谱图纪录，RSD为0.4%，以峰面积计算，结果显示精密度良好。取上述供试品溶液，室温下放置，分别与0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h测定，有关物质和主成分峰面积的RSD 分别为0.5%、0.3%，提示24 h 内供试品溶液稳定。

1.2.8 加样回收率试验 分别在25 mL量瓶中加入1.2.3下获取的对照品溶液3 mL、2 mL、1 mL，分别加入1.2.3 制备的10 mL供试品溶液，加入250∶680∶70比例的甲醇—水—乙腈稀释至刻度，根据1.2.1 色谱条件进样10 μL，对色谱图纪录，结果显示3 个浓度的回收率为100.2%、99.7%、99.8%，RSD 分别为0.3%、0.5%、0.4%，平均回收率为99.9%。

2 讨论

西咪替丁能够竞争性结合壁细胞上分布的H2 受体，抑制组胺，拮抗胃酸分泌，与其他H2 受体拮抗剂相比，抑酸作用较强，被广泛应用于胃溃疡、上消化道出血、十二指肠溃疡等疾病治疗［6-7］。西咪替丁还能调节机体免疫功能，使T 淋巴细胞的转化率提高，增强抗组胺作用，使毛细血管的通透性提高，减少前列腺素缩放，降低发热反应所需的介质，起到降温作用，能够使病毒对皮肤的损伤减小，还能减轻因组胺所致的水肿、出血等症状［7-8］。另外，西咪替丁的主要吸收部位为消化道上端，药物并未完全释放，降低生物利用度。故准确检测西咪替丁片含量及其有关物质和含量对于临床治疗方案的制定至关重要。

紫外-可见分光光度法、色谱-质谱法、流动注射-抑制化学发光法等常用的药物含量检测方式，均存在一定局限性，如紫外-可见分光光度法敏感度低。色谱-质谱法检测设备昂贵，难以在基层医院推广。流动注射-抑制化学发光法操作繁琐等［9-10］。HPLC 法是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，用高压输液系统将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的缓冲液、混合溶剂等流动相泵入装有固定相的色谱柱，分离柱内各成分后置入检测器实施检测，最终分析试样，已成为工业、农学、化学、医学等学科领域中重要的分离分析技术［11-13］。HPLC 法系统的组成主要包括高压输液系统、进样系统、色谱柱及检测器，其中高压输液系统是由脱气装置、贮液罐、过滤器、高压输液泵及梯度洗脱装置组成，贮液罐位置需高于泵体，维持良好输液静压差，且使用过程中需密闭，避免蒸发所致流动相组成变化，且能阻止气体进入。脱气装置则能够帮助流动相使用前唾弃，避免进入系统低压部分后逸出气泡，从而确保柱分离效率，降低对检测器灵敏度的影响。高压输液泵则为关键部件，能够完成流动相输送，此外进样系统、色谱柱、检测器均具有重要作用，多部件组成的高效液相色谱仪方可获得选择性好、分离效能高、分析速度快、适用范围广等特点，且兼具分离及分析功能，可实现在线检测。本研究中，西咪替丁与有关物质分离好，其与周围的有关物质峰分离度＞9。浓度范围在4.928～123.2 μg/mL，线性关系良好，r=0.999 8。加样平均回收率为99.9%。测定西咪替丁检测限与定量限分别为1.035 μg/mL、5.136 μg/mL，提示HPLC 法检测敏感度高、专属性强、结果准确，可用于检测西咪替丁片的含量与有关物质的测定。HPLC 法分析原理在于能够改变流动相极性，使得样品各组成在最佳条件下分离，且分离过程与其他色谱一样，也需溶质在固定相、流动相间进行多次连续交换，借助溶质在两相间分配系数、吸附力、亲和力或分子大小不同引起的排阻作用差来分离不同溶质［15-16］。HPLC 法检测具有以下几点优势：分析速度快、载液流速快，一般分析一个样本所需15～30 min，部分样本可在5 min 内完成，速度明显高于经典液体色谱法速度。分离效能高，可经选择流动相、固定相，以达到最佳分离效果，远高于气相色谱及工业精馏塔的分离效能［17］。紫外检测器可达0.01 ng，进样量在μL 数量级，敏感度较高。可分析70%以上的有机化合物，尤其能够分离大分子、高沸点、热稳定性差、强极性等化合物的分离，应用范围广。色谱柱可反复使用、样品量少、容易回收。

综上所述，HPLC 法检测具有快速、准确、操作简便、专属性强等优点，可用于检测西咪替丁片的含量与有关物质的测定。