复合乳清蛋白粉改善小鼠记忆力功能研究

郭月逸，郭豫,2，赵建,2，赵江燕,2，闫文杰,2

（1.北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心，北京 100191；2.北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京 100191）

0 引言

记忆是思维、推理等心理过程的基础，是大脑对过去经历过事物的储存和再现。导致记忆下降的原因有很多，包括压力上升、机体衰老、代谢综合征和风险基因等[1]。现今社会发展迅速，生活节奏的加快以及工作学习压力的增加，压力诱发的抑郁、焦虑、失眠等情况又会对大脑造成一定的损伤，影响记忆力[2]。为了缓解这一情况，研发保护大脑功能以改善记忆的功能性食品成为热点。

乳清蛋白是分离和沉淀乳酪蛋白时保留在上清液中的蛋白质成分[3-4]。它是一种优质蛋白，经常被用作人体的高质量蛋白质补充剂[5]。乳清蛋白在水解后可以释放大量的生物活性肽，这些活性物质可以作用于免疫系统、心血管系统、消化系统，具有很高的营养价值[6]。近些年来乳清蛋白的研究逐渐兴起，其对于改善记忆力的作用被越来越多研究者发现[7-8]。磷脂不仅是体内核膜和细胞膜的主要成分，控制了膜内外物质和信息的传递，还参与脂类的消化、吸收和转运。对基础代谢和信号传递都能发挥重大作用[9-10]。它对于机体大脑神经的生长发育至关重要，具有改善记忆，增强认知的作用[11-15]。牛磺酸又称β-氨基乙磺酸，它在中枢神经系统中特异性分布于大脑皮质，海马和小脑等区域。近年来的研究表明，牛磺酸作为一种神经营养因子，可以促进神经系统生长发育、增殖分化并且对神经系统具有保护作用[16-17]。

3种功能成分均具有增强认知改善记忆力的功能。但是受限于单一组分对改善记忆功效的剂量要求较高，并且保健食品就是体现配伍的协同增效作用，本研究选用含有磷脂的乳清蛋白粉与牛磺酸复配，探讨该成分的协同作用，评估该样品对小鼠改善记忆力的作用，研究该样品对改善小鼠记忆力的最佳剂量，为研制改善认知和记忆的功能食品提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK（京）2019-0008]繁殖的288只SPF级昆明种雄性小鼠，体重为18～22 g，分两次进行试验。每次试验分为3批每批48只进行。分别进行跳台实验、避暗实验、水迷宫实验。实验动物在北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心SPF级动物室饲养。本研究经北京联合大学伦理委员会审核和批准。

1.2 样品与剂量

选用含有5%磷脂的浓缩乳清蛋白粉，来自于新西兰恒天然集团。磷脂中的各组分含量为：磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）26.4%、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）26.6%、磷 脂 酰 肌 醇（phosphatidylinositol，PI）8.4%、磷酯酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）12.7%、鞘磷脂25.0%。按照乳清蛋白粉（含磷脂5%）10.0 g、牛磺酸0.6 g的人体每日摄入量配方，实验设低剂量组（0.88 g/kg体质量）、中剂量组（1.77 g/kg体质量）、高剂量组（3.53g/kg体质量），分别为人体推荐剂量的5倍、10倍、20倍。根据《保健食品功能检验与评价方法（2022年版）》征求意见稿：对给予受试样品剂量的要求，各种动物实验至少应设3个剂量组，其中一个剂量应相当于人体推荐摄入量的5倍（大鼠）或10倍（小鼠），且最高剂量不得超过人体推荐摄入量的30倍。本研究样品最大使用浓度为人体推荐摄入量的20倍，所以选择5倍，10倍，20倍为灌胃剂量。同时设置模型对照组（0 g/kg体质量）。每日经口灌胃给予一次受试物，对照组灌胃无菌水，灌胃体积为10 mL/kg体质量。连续灌胃30 d后分别进行实验。模型对照组和各剂量组在实验训练前10 min腹腔注射东莨菪碱5 mg/kg体质量，注射体积为10 mL/kg体质量。各剂量组均给予维持饲料。

1.3 试剂和仪器

东莨菪碱，阿拉丁科技（中国）有限公司；ACh测定试剂盒、AChE测试盒、总蛋白测定试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。

YLB-3TB跳台记录仪，北京众实迪创科技发展有限责任公司；LE870系列避暗箱，西班牙PanLab公司；自制水迷宫；T1000电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；BS2202S电子天平，德国赛多利斯公司。

1.4 实验方法

本研究通过观察小鼠在行为学实验中的表现，以及脑组织中的生化指标，来判断该受试物对小鼠改善记忆力能力的影响。

1.4.1 跳台实验（step down test）

在末次给样后第二天开始训练。训练前3 min将小鼠放入实验箱中适应环境，之后将小鼠放在实验箱底部并接通电路，使小鼠遭受电刺激并跳上绝缘平台。经过一次电刺激后，将小鼠放在绝缘平台上，记录各组小鼠300 s内错误潜伏期（首次跳下平台的时间）和跳下平台的错误次数。并计算各组小鼠的错误动物数和错误动物百分率，将此成绩作为测试期成绩。经过24 h后将实验时间改为180 s进行并记录重测期实验。停止训练7 d后，按照重测期实验方法进行并记录消退期实验。

1.4.2 避暗实验（step through test）

在末次给样后第二天开始训练。实验箱分两部分，宽敞明亮的明室和密闭黑暗的暗室，中间有洞口使两个部分相连。以小鼠面部背向暗室放入明室作为实验开始计时，记录各组小鼠300 s内的错误潜伏期（第一次进入暗室遭受电击所需的时间）以及遭受电击的错误次数。并计算各组小鼠的错误动物数和错误动物百分率，将此成绩作为测试期成绩。经过24 h后进行并记录重测期实验。停止训练7 d后，按重测期实验方法进行并记录消退期实验。

1.4.3 水迷宫实验（water maze test）

在末次给样后第二天开始训练。每次训练之前，将小鼠面向迷宫放在终点附近自主爬上1次，使让小鼠熟悉终点的方向和位置。如果小鼠训练或测试时没有在120 s内到达终点，应引导其到达终点，并将到达终点时间记录为120 s。实验分阶段进行，根据小鼠学习成绩逐渐加长路程。首次训练让小鼠从A点出发。第二阶段训练从B点开始，当80%以上动物数在120 s内到达终点后结束本阶段训练。末次测试从S点开始。记录各小鼠训练期及测试期到达终点所需的时间、错误的次数、到达终点动物数以及到达终点动物百分率，并计算各剂量组总和。停止训练7 d后从S点开始进行并记录消退期试验。

1.4.4 小鼠脑组织生化指标测定

行为学实验结束后，每组选取12只小鼠断头取脑组织，按照试剂盒说明书进行预处理，检测各剂量组小鼠Ach、AchE水平。

1.5 数据统计

数据处理使用SPSS软件。计数资料使用x2检验。计量资料以±s表示，采用方差分析，方差不齐的数据改用秩和检验进行统计。

1.6 结果判定

跳台实验、避暗实验、水迷宫实验中任意两项实验结果阳性，且重复实验结果一致，可以判定该受试样品辅助改善记忆动物实验阳性。

2 结果与讨论

2.1 单一样品和复合样品的比较研究

为了观察复合样品对小鼠的改善记忆功能是否优于单一组分，设置模型对照组（0 g/kg体质量）、复合样品组（3.53 g/kg体质量）、磷脂组（0.17 g/kg体质量）、牛磺酸组（0.20 g/kg体质量）、乳清蛋白组、（3.16 g/kg体质量）进行跳台实验。与模型对照组比较，各剂量组错误潜伏期差异未见显著性（P>0.05），但是复合样品组错误潜伏期与其他各组比较均有延长的趋势，如表1所示；与模型对照组比较，复合样品组测试期错误次数显著减少（P<0.05），同时复合样品组测试期错误次数与其他各组比较均有减少的趋势，如表2所示；与模型对照组比较，各剂量组错误动物数差异未见统计学差异（P>0.05），如表3所示。结果表明复合样品组在改善小鼠记忆力作用上，优于其单独组分。

表1 对小鼠跳台实验错误潜伏期的影响（±s）

表1 对小鼠跳台实验错误潜伏期的影响（±s）

错误潜伏期/s测试期 重测期 消退期模型对照组 6 165.3±110.1 160.0±24.9 165.4±33.1复合样品组 6 197.3±112.6 176.2±9.2 180.0±0.0磷脂组 6 171.4±79.8 164.3±24.6 173.8±15.2牛磺酸组 6 175.0±102.2 174.5±13.4 180.0±0.0乳清蛋白粉组 6 153.7±91.9 167.3±20.0 176.3±9.1组别 动物数/只

表2 对小鼠跳台实验错误次数的影响

表3 对小鼠跳台实验错误动物数的影响

2.2 对小鼠跳台实验的影响

在跳台实验中，由于小鼠的正常活动被狭小的绝缘平台限制了，导致它尝试跳下平台进入更舒展的空间而遭受到电击。因此小鼠在跳台实验中的错误潜伏期以及错误次数，能够反映该受试物对小鼠的改善记忆作用。如表4所示，两次实验各剂量组与模型对照组比较，错误潜伏期未见统计学差异。如表5所示，与模型对照组比较，第一次实验中剂量组，测试期错误次数显著减少（P<0.05）；第二次实验各剂量组，测试期错误次数显著减少（P<0.01）。如表6所示，两次实验各剂量组与模型对照组比较，错误动物数未见统计学差异。复合乳清蛋白粉跳台实验能减少小鼠错误次数，并且重复试验结果一致。表明在跳台实验该受试物可以明显改善小鼠记忆力。

表4 对小鼠跳台实验错误潜伏期的影响（±s）

表4 对小鼠跳台实验错误潜伏期的影响（±s）

第一次实验错误潜伏期/s组别 动物数/只测试期 重测期模型对照组 12 166.0±108.6 170.0±23.3低剂量 12 154.6±129.1 155.3±49.6中剂量 12 153.1±130.4 131.9±67.7高剂量 12 132.4±97.5 166.1±27.3消退期179.1±3.2 179.5±1.7 180.0±0.0 178.8±4.3第二次实验错误潜伏期/s测试期156.6±133.4 204.7±116.9 165.4±124.0 152.7±125.5重测期 消退期168.7±39.1 166.0±33.2 147.1±53.2 177.9±4.9 164.9±33.0 180.0±0.2 171.9±28.1 179.8±0.9

表5 对小鼠跳台实验错误次数的影响

表6 对小鼠跳台实验错误动物数的影响

2.3 对小鼠避暗实验的影响

避暗实验是利用了小鼠喜欢黑暗环境的本性，明亮的光照环境会使小鼠焦虑烦躁，让它迫切的想要进入黑暗密闭的空间，当它移动至暗室时便会遭受电击。因此小鼠在避暗实验中的错误潜伏期及错误次数，能够反映该受试物对小鼠的改善记忆力作用。如表7所示，与模型对照组比较，第一次实验高剂量组重测期错误潜伏期显著延长（P<0.05），中剂量组虽没有统计学差异，但是重测期错误潜伏期有延长的趋势；第二次实验中、高剂量组测试期错误潜伏期延长，有统计学差异（P<0.01）；低剂量组重测期错误潜伏期显著延长（P<0.05），中、高剂量组虽没有统计学差异，但是重测期错误潜伏期有延长的趋势。如表8所示，与模型对照组比较，第一次实验中、高剂量组重测期错误次数显著减少（P<0.05），低剂量组虽没有统计学差异，但是重测期错误次数有减少的趋势；第二次实验各剂量组重测期错误次数均显著减少（P<0.05）。如表9所示，与模型对照组比较，第二次实验低剂量组重测期错误动物数显著减少（P<0.05）。复合乳清蛋白粉避暗实验能减少小鼠错误次数，并且重复试验结果一致，表明在避暗实验该受试物可以明显改善小鼠记忆力。

表7 对小鼠避暗实验错误潜伏期的影响（±s）

表7 对小鼠避暗实验错误潜伏期的影响（±s）

注：与模型对照组比较，*表示有统计学差异（P<0.05），**表示有统计学差异（P<0.01）。

第一次实验错误潜伏期/s组别 动物数/只测试期 重测期模型对照组 12 43.4±33.4 158.2±126.9低剂量 12 38.9±25.7 162.2±111.2中剂量 12 65.9±37.1 245.7±102.9消退期296.1±13.4 250.3±90.2 275.7±58.3第二次实验错误潜伏期/s测试期66.8±32.2 99.1±69.3 134.3±69.2**重测期 消退期123.6±48.1 264.7±67.8 222.1±91.2* 282.9±40.9 175.3±104.4 265.9±83.9高剂量 12 55.3±26.8 273.6±46.6* 270.8±54.1 127.7±71.1** 186.7±113.5 237.5±80.6

表8 对小鼠避暗实验错误次数的影响

表9 对小鼠避暗实验错误动物数的影响

（续表9）

2.4 对小鼠水迷宫实验的影响

小鼠方向感以及空间位置感的记忆能力能够通过水迷宫实验反映出来，因此小鼠在水迷宫实验中到达终点时间，错误次数，反映该受试物对小鼠的改善记忆力作用。如表10所示，与模型对照组比较，第一次实验中剂量组第2次训练到达终点时间显著减少（P＜0.05）。如表11所示，第二次实验各剂量组与模型对照组比较，到达终点时间未见统计学差异。如表12～13所示，与模型对照组比较，第一次实验低剂量组第2次训练、消退期和第二次实验中剂量组第2次训练错误次数显著减少（P＜0.05）。如图1～2所示，两次实验各剂量组与模型对照组比较，到达终点动物数未见统计学差异。复合乳清蛋白粉在水迷宫实验能减少小鼠训练时期错误次数，并且重复试验结果一致，表明在水迷宫实验该受试物可以明显改善小鼠记忆力。

图1 水迷宫实验到达终点动物数和百分率（第1次）

表10 对小鼠水迷宫实验到达终点时间的影响（第一次）（±s）

表10 对小鼠水迷宫实验到达终点时间的影响（第一次）（±s）

注：与模型对照组比较，*表示有统计学差异（P＜0.05）。

组别 动物数/只 到达终点时间/s第1次训练 第2次训练 第3次训练 第4次训练 测试期 总时间 消退期模型对照组 12 33.4±25.5 95.1±32.1 71.2±36.9 60.1±39.4 65.0±36.7 324.8±95.7 72.3±44.0低剂量 12 35.6±34.0 85.2±41.9 72.7±38.6 52.9±41.8 71.6±40.3 317.9±110.9 62.4±41.6中剂量 12 22.6±31.8 67.3±42.2* 61.6±46.5 65.9±40.4 86.8±42.9 304.3±95.5 73.2±43.1高剂量 12 28.3±27.5 92.9±24.4 72.6±39.1 60.1±37.8 76.1±35.8 330.0±64.1 55.8±40.3

表11 对小鼠水迷宫实验到达终点时间的影响（第二次）（±s）

表11 对小鼠水迷宫实验到达终点时间的影响（第二次）（±s）

组别 动物数/只 到达终点时间/s第1次训练 第2次训练 第3次训练 测试期 总时间 消退期模型对照组 12 23.1±24.7 70.1±37.9 70.1±38.3 55.9±39.7 219.2±70.5 58.4±44.0低剂量 12 14.8±9.7 76.6±47.6 67.4±41.9 60.9±39.4 219.8±77.4 61.8±34.9中剂量 12 36.3±31.3 78.8±33.1 48.1±42.2 56.9±40.7 223.1±93.7 76.0±44.0高剂量 12 32.4±29.2 91.1±35.0 55.9±42.4 61.9±29.3 241.3±67.8 52.7±27.9

表12 对小鼠水迷宫实验错误次数的影响（第一次）

表13 对小鼠水迷宫实验错误次数的影响（第二次）

图2 水迷宫实验到达终点动物数和百分率（第2次）

2.5 对小鼠脑组织生化指标的影响

中枢神经系统中，胆碱能神经系统参与应激和学习记忆等重要活动。ACh是神经系统中重要神经递质，其含量可以影响学习记忆的能力，在改善记忆力中具有重要的作用。AChE是胆碱能系统中的关键指标，该酶可以降解乙酰胆碱，影响机体的学习记忆能力。如图3所示，与模型对照组比较，各剂量组小鼠脑组织中ACh的含量均升高，有统计学差异（P<0.01）。

图3 对小鼠脑组织Ach含量的影响

如图4所示，与模型对照组比较，各剂量组小鼠脑组织中AChE活力均降低，有统计学差异（P<0.01）。本研究给予小鼠受试物后，小鼠行为学实验表明各剂量组小鼠的记忆力显著提高。并且各剂量组与模型对照组比较，小鼠脑组织中的ACh含量显著上升，AChE活力显著下降。提示复合乳清蛋白粉改善小鼠记忆力的可能机制是改善调节中枢胆碱能系统。

图4 对小鼠脑AChE活力的影响

3 结 论

学习记忆能力是指人和动物根据获得经验的反馈，更改自身行动以适应环境变化的过程。一般认为，海马结构和大脑中神经元和突触之间的相互作用是维持其功能的重要因素[18]。张建东等[19]研究发现添加大豆PC喂养幼年大鼠，可促进其海马结构突触的增长，使海马突触素的免疫表达增强，提高了突触的可塑性，进而提高幼年大鼠的空间辨别性学习记忆能力。程晓范等[20]研究表明，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰丝氨酸复合软胶囊均可以改善小鼠记忆功能。雷孟洁等[21]的研究表明，磷脂酰丝氨酸不仅可以显著增加脑组织中ACh含量，还可以显著增加Na+-K+-ATPase的活性。明显改善东莨菪碱诱导记忆障碍小鼠的学习记忆能力。ACh是重要的神经递质之一，其在脑组织中的水平可以明显反应机体的学习记忆能力。脑组织中的Na+-K+-ATPase是维持神经细胞内外离子平衡及神经传递的重要物质。此酶活力的下降会造成细胞内环境紊乱，对学习记忆能力造成不良影响。齐微微等[22]的研究表明乳清蛋白肽可以调节脑组织AChE的活性，提高衰老小鼠学习记忆认知功能。AChE的是乙酰胆碱的水解酶，其活力变化可以间接反应脑组织中ACh的含量和代谢情况。当AChE的活性明显升高，造成ACh的含量降低，导致中枢神经系统功能紊乱，出现认知功能和学习记忆能力下降。Santoro M等[23]发现牛磺酸可通过促进一些长链非编码RNA的表达,参与修复某些神经退行性疾病。张兆一等[24]研究指出，补充牛磺酸的成年大鼠，学习记忆能力增强。通过已报道文献和本研究的结果可以推测，复合乳清蛋白粉通过增加小鼠脑组织ACh的含量并且抑制AChE的活性，达到改善小鼠记忆力的作用，其具体机制还有待进一步研究。罗建[25]研究表明剂量为0.1 g/kg体质量的PC可以有效改善小鼠记忆力。有研究表明50 mg/kg体质量为PS改善记忆力的有效剂量[20]。本研究中各组分的用量略少于单一原料的有效剂量，但此复合原料同样达到了增强小鼠记忆力的功能，推测本复合原料互相具有协同作用。

本研究结果表明：中剂量组可以减少跳台实验测试期错误次数；可以减少避暗实验重测期错误次数。高剂量组可以减少避暗实验重测期错误次数。各剂量组均可以提高小鼠脑组织ACh含量，降低小鼠脑组织AChE活力。综上所述，复合乳清蛋白粉具有辅助改善记忆力的功能，其作用机制是通过调节小鼠中枢胆碱能系统从而改善小鼠记忆力。本研究结果可为改善记忆类功能食品提供实验基础和开发依据。