干酪乳酪杆菌Zhang VBNC态在不同复苏基质中的代谢物组学研究

包秋华，王会莹，张雨虹

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，农业农村部奶制品加工重点实验室，内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室 呼和浩特 010018）

0 引言

代谢组学（Metabolomics）是专门用来研究一个生物体的基因或其所在的环境发生变化后，它具有内源性代谢产物的品种、数量及其变化规律的科学，可以对某生物或细胞在一定特殊时期的所有比较低的分子质量代谢物（<1 000）进行定性或定量分析的一门学科[1-2]。超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱技术（Ul

tra-performance liquid chromatography-quadrupoletime of flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF MS）是代谢组学研究中使用广泛的分析工具之一，具有较高的色谱峰分辨率、较短的分析时间和较强的检测灵敏度等优点，适用于各种复杂样品微量成分的分离和分析[2-3]。

一些细菌在不利生长的逆境胁迫条件下会进入一种活的非可培养（Viable but nonculturable，VBNC）态，其在常规培养基上无法生长，但仍具有低的代谢活性，当条件适宜时又可以恢复生长繁殖能力复苏到可培养态[4-5]。目前已证实100多种微生物（包括细菌、真菌）可进入VBNC态[4-5]。不同种类的微生物VBNC态复苏方法不尽相同，常见的复苏方法有升温法、添加有机物法、富营养法、生物法等[4-10]。致病菌VBNC态的复苏会给食品安全和人类健康带来潜在威胁[4-11]。非致病菌的复苏可能会增加活菌数量、利于挖掘自然界中不可培养微生物资源等[12-13]。目前对微生物VBNC态的复苏机理尚不明确。由于不同微生物在不同复苏条件下代谢变化不尽相同，是一个极其复杂的过程，因此分析不同复苏条件下代谢物差异将有利于解析其复苏机理。

干酪乳酪杆菌Zhang（Lacticaseibacillus casei Zhang，缩写L.casei Zhang）是分离自内蒙古地区传统酸马奶中一株具有耐酸、耐胆盐、抗氧化、改善肠道菌群等多种益生功能的乳杆菌，是我国完成的第一株全基因组测序的乳酸菌[14-17]。需要补充说明的是此菌根据2020年乳杆菌属的分类地位变迁[18]才改为现在的名称。以前称为Lacticaseibacillus casei Zhang或L.casei Zhang，目前该菌已经在食品、美妆、医药及畜牧业等领域中被广泛应用[15-18]。

前期研究发现益生菌L.casei Zhang在某些逆境条件下能够进入VBNC态[19]。关于益生菌在不同基质中复苏的代谢物差异变化鲜有报道，因此本试验主要利用UPLC-Q-TOF MS技术，对L.casei Zhang VBNC态在二种常用的乳酸菌活化培养基（液体MRS培养基和脱脂乳）中复苏的差异代谢物进行检测和分析，旨在从代谢组学的角度对其复苏机理进行初探。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

本实验所用L.casei Zhang由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

1.1.2 试剂

乙腈（色谱级）、甲醇（色谱级），CNW科技公司；异亮氨酸脑啡肽，美国Waters公司；氨水（色谱级），Sigma公司；MRS液体培养基、脱脂乳，Oxoid公司。

1.1.3 仪器与设备

ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q-Tof超高效液相-四级杆-飞行时间质谱仪（UPLC-Q-TOF MS），美国Waters公司；MoFlo AstriosEQ流式细胞分选仪，美国Beckman Coulter有限公司；Milli-Q纯水仪，Millipore公司；DHP-9272恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；SX-700高压蒸汽灭菌锅，日本Tomy Digital Biology公司。

1.2 方法

1.2.1 L.casei Zhang的诱导及复苏

参照陈鹿[11]、王亚利[12]等人方法将活化的L.casei Zhang在液体MRS培养基（pH3.8）中在4℃低温条件下180 d左右使其进入VBNC态，然后采用MoFlo AstriosEQ流式分选细胞仪对L.casei Zhang VBNC诱导液按细胞亚群（活菌、死菌和VBNC态）进行分区，将其VBNC态细胞分选入指定管（专利需要，数据略），分别接入脱脂乳和MRS液体培养基中，37℃恒温培养24 h，传三代至复苏。

1.2.2 UPLC-Q-TOF MS分析

（1）样品前处理。参照彭江英[20]等乳清样本前处理方法，即：取两种复苏样品各1 mL于5 mL EP管中，加入1/3体积的乙腈，充分混匀，10 000 g高速离心10 min，吸取上清液于新的5 mL EP管中，加入1/3体积的乙腈，充分混匀，4℃静置2 h，12 000 g离心5 min，取上清液，旋转蒸发浓缩9 h后，加1 mL 40%乙腈溶液复溶，8 000 g离心5 min后用0.22 μm微孔滤膜过滤于上样瓶中，上机测定。将每个样品各吸15 μL加入同一上样瓶中，与待测样品以同样的方式进行处理后，作为质量检测（Quality control，QC）样本。

（2）高效色谱条件。色谱柱：Waters BEHC18；设定柱状烘箱温度：35℃；流速：0.45 mL/min；每个样品的进样量：10 μL。正离子扫描模式下：流动相由溶剂A（水＋0.1%甲酸）和溶剂B（0.1%甲酸+乙腈）组成；负离子扫描模式下：流动相由溶剂A（水＋0.1%氨水）和溶剂B（纯乙腈溶液）组成。梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

需要补充说明的是梯度洗脱中梯度变化的速率会影响物质的出峰时间和分离效果，实际测样过程中主要根据分离结果来调整梯度变化的速率。本研究所采取的洗脱速率，样品中的物质可以达到最佳的分离效果。

（3）质谱条件。参照马立清[21]等质谱条件的设定，质谱采用ESI源正、负离子（ESI+/ESI-）模式进行采集，质核比扫描范围设定在50～1 000 m/z。为确保仪器的准确性和数据的重现性，采用浓度为2 ng/mL亮氨酸脑啡肽为校正液（正离子模式下质荷比设定为556.277 1 m/z，负离子模式下质荷比设定为554.261 5 m/z），具体参数设置为：毛细管电压2.5 kV，样品锥孔电压40 kV，离子源温度100℃，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量600 L/h，锥孔气流速50 h/L。

1.3 数据处理和统计学分析

经过UPLC-Q-TOF MS获得的原始数据经转化及预处理后，将数据导入SIMCA 14.1软件结合Metaboanalyst 5.0进行多元统计分析，包括主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等。依据P<0.05，FC>2和VIP≥1相结合的条件筛选获得差异代谢物。筛选出的差异代谢物通过KEGG数据库进行匹配确定最终差异代谢物。

2 结果与讨论

2.1 两种复苏基质下的PCA图分析

利用UPLC-Q-TOF MS代谢组学技术研究L.casei Zhang VBNC态在两种复苏基质中的代谢物质。测试数据结果显示，在正离子和负离子模式下分别得到2 735种和1 717种代谢物。由于主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是一种常用的无监督的统计方法，通过将多维数据降维转化成几个综合主成分来评估样本的分类状态[21]。可以反应不同样品的分组情况以及整体数据的稳定性[20]。所以本文对两种复苏基质的样品进行PCA分析，结果见图1。

图1 两种复苏状态下PCA图分析

PCA图中样本点之间的距离能反映样本间代谢物的相似性和差异性。由图1可知，在ESI+和ESI-模式下，QC样本相对聚集，表明数据采集过程中仪器具有较高的准确性及稳定性，所得数据较为准确。L.casei Zhang VBNC态在MRS培养基（编号为MRS）、脱脂乳(编号为TZR)两种复苏基质样本中组内分布相对聚集，平行性较好；组间分离明显，说明两组样本代谢物具有明显差异。

2.2 两种复苏基质下的OPLS-DA图分析

PCA分析虽能通过原始数据直观反映两组样本间的整体差异，但无法消除随机以及组内误差，为了使结果更加准确，可运用OPLS-DA（正交偏最小二乘法-判别分析）法，除去自变量X中与随机变量Y无关的数据，使得分类数据集中在一个主成分中，用于评估OPLS-DA图是否存在过拟合情况[22]。OPLS-DA结果见图2。判别分析具体参数结果如下，图2（a）（正离子模式）：R2Y=1，Q2=0.995；图2（b）（负离子模式）：R2Y=1，Q2=0.991。其中R2Y表示所建模型对Y轴方向的解释率，Q2表示对模型的预测能力，R2Y和Q2结果越接近1，说明模型越稳定可靠[23]。本试验中R2Y结果均等于1，Q2结果均接近于1，表明在正离子和负离子两种模式下，MRS培养基（编号为MRS）、脱脂乳(编号为TZR)两种复苏样品组内分布相对聚集，平行性较好；组间分离良好，两种样品在复苏过程中产生的代谢物在统计学上存在明显差异，具有一定的统计学意义。

图2 两种复苏状态下OPLS-DA图分析

由于OPLS-DA分析方法在代谢数据样本量小的情况下会出现过拟合现象导致数据结果不准确，因此需要采用置换检验来验证OPLS-DA检测结果是否为假阳性[23]。正、负离子模式下200次随机置换检验结果见图3。通常R2的截距应明显小于模型变量的解释度，Q2的截距也应该明显小于预测度[22]。由图3中可以看出Q2截距小于R2，说明OPLS-DA模型有效，数据不存在假阳性。

图3 两种复苏状态下置换检验图分析

2.3 两种复苏基质下细胞差异代谢物的筛选

L.casei Zhang VBNC态在液体MRS和脱脂乳中的复苏样本经过UPLC-Q-TOF MS获得的原始数据预处理后，在正离子和负离子模式下分别得到2 735种和1 717种代谢物，随后根据P<0.05、FC>2和VIP≥1的筛选原则，并通过KEGG数据库比对鉴定得到了22个主要差异代谢物，具体差异代谢物见表2。

从表2可以看出，L.casei Zhang VBNC态在2种不同复苏基质下筛选出的22个主要差异代谢物，分为氨基酸类、糖类、维生素类、脂类和嘌呤类共5类。其中，有18种代谢物（甘氨酸、L-谷氨酰胺、赖氨酸、L-瓜氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、D-氨基葡萄糖、低聚木糖、烟酰胺、甲基钴胺素水合物、亚叶酸、甲萘醌、棕榈酸、4-氨基丁酸酯、甘油、3'-磷酸腺苷硫酸酯、鸟苷和黄嘌呤）在液体MRS复苏基质中的相对含量高于在脱脂乳复苏基质中；有4种代谢物（S-核糖基-L-高半胱氨酸、乳糖、核黄素和(R)-3-羟基丁酸酯）在脱脂乳复苏基质中的相对含量高于在液体MRS复苏基质中。这些差异代谢物的合成可能对L.casei Zhang VBNC态复苏起关键作用。下面对主要差异代谢物按类进行分析。

表2 L.casei Zhang VBNC态在MRS和脱脂乳中复苏的差异代谢物

（续表2）

2.4 主要差异代谢物的分类分析

2.4.1 氨基酸类

从表2可以看出，L.casei Zhang VBNC态在液体MRS和脱脂乳两种复苏基质中主要氨基酸类差异代谢物有7种，其中在液体MRS复苏基质中主要氨基酸差异代谢物有6种（包括甘氨酸、L-谷氨酰胺、赖氨酸、L-瓜氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸）。有研究表明氨基酸是构建细胞、修复组织的基础材料，是调节代谢，增加抵抗力所需物质[24]。L-苏氨酸可由糖类物质生物转化而成，甘氨酸既可以由糖类物质生物合成，也可以由前述的L-苏氨酸通过生物转化合成。同时甘氨酸的积累能对菌株生长提供所需的氮源，同时也能促进菌株体内蛋白质的合成[25]。另外，L-谷氨酰胺主要通过谷氨酰合成酶和谷氨酸脱氢酶转化而成，L-谷氨酰胺有效降低菌在逆境胁迫中受到的氧化损伤程度，并提高酿酒酵母的活力[26]。对于大肠杆菌VBNC态复苏的研究过程中，通过向培养基中添加不同的氨基酸组合可使细胞从VBNC状态转变为复苏态[27]。因此推测在MRS基质中积累的6种氨基酸对L.casei Zhang VBNC态的复苏发挥一定作用。

在脱脂乳复苏基质中主要氨基酸差异代谢物是S-核糖基-L-高半胱氨酸。由于半胱氨酸是生物体内常见的硫源供体，L-半胱氨酸是蛋氨酸、硫胺素以及谷胱甘肽等生物体内常见物质的重要组成成分[28]。因此推测S-核糖基-L-高半胱氨酸在脱脂乳中的积累对L.casei Zhang VBNC态的复苏发挥作用。

2.4.2 糖类

从表2可以看出，L.casei Zhang VBNC态在液体MRS和脱脂乳两种复苏基质中主要糖类的差异代谢物有3种，其中在液体MRS复苏基质中显著增加的有低聚木糖和D-氨基葡萄糖。低聚木糖是由2～9个木糖分子通过β-1,4糖苷键连接而成，近年来的研究表明，低聚木糖具有多种生物活性，低聚木糖可作为益生元可为双岐杆菌和乳酸菌供能，从而刺激菌体的生长和增值[29-30]。由此推测在液体MRS复苏基质中低聚木糖的积累有利于L.casei Zhang VBNC态菌复苏。此外，在脱脂乳复苏基质中显著增加的是乳糖，糖类提供菌株生长过程中的营养物质，有利于L.casei Zhang VBNC态的复苏。

2.4.3 维生素类

从表2可以看出，L.casei Zhang VBNC态在两种复苏基质中有显著差异的维生素为烟酰胺、核黄素、甲基钴胺素水合物、亚叶酸和甲萘醌。由于烟酰胺参与生物体内糖原分解、脂类代谢及各种物质的氧化作用，是一种潜在抗氧化性物质[31]。嗜酸乳杆菌发酵枣汁后的代谢产物中烟酰胺含量增加[31]。与本文结果烟酰胺含量增加结果一致，因此推测L.casei Zhang VBNC态在液体MRS复苏的过程中，L.casei Zhang抗氧化能力被逐渐恢复。此外，核黄素是生物体内作为重要辅酶黄素腺嘌呤二核甘酸（FAD）和黄素单核甘酸（FMN）的前体存在，能促进蛋白质、脂肪、碳水化合物的代谢[32]。相较于MRS培养基，在脱脂乳复苏基质中核黄素含量明显增加，因此，推测核黄素对L.casei Zhang VBNC态在脱脂乳复苏基质中起作用。

2.4.4 脂类

从表2可以看出，L.casei Zhang VBNC态在液体MRS和脱脂乳两种复苏基质中主要脂类的差异代谢物有5种。其中在液体MRS复苏基质中显著增加的脂类有4种（棕榈酸、4-氨基丁酸酯等物质），在脱脂乳复苏基质中显著增加的有1种（（R）-3-羟基丁酸酯）。由于脂类是维持菌体正常生长所必需的物质，能促进脂溶性维生素吸收和利用，可作为能量和碳源的储存物质，因此脂类物质的增加对VBNC态菌株的复苏及生长发挥着重要的作用。

2.4.5 嘌呤类

从表2可以看出，L.casei Zhang VBNC态经液体MRS复苏后，鸟苷（嘌呤）和黄嘌呤这2种核苷酸代谢物呈显著性增加的趋势。由于嘌呤是细胞内最主要的小分子代谢物之一，是遗传信息传递的基础、核苷酸的重要组成部分，是储存能量的主要生物分子[33]。因此推测2种嘌呤类物质为L.casei Zhang VBNC态的生长代谢提供了一定的条件。

3 结 论

本研究利用UPLC-Q-TOF MS技术对L.casei Zhang VBNC态在液体MRS培养基和脱脂乳二种复苏基质中的代谢物进行解析，通过多变量统计分析共筛选出差异代谢物22种，其中甘氨酸、低聚木糖、烟酰胺等18个代谢物在液体MRS培养基中的相对含量显著高于脱脂乳，其余4种（S-核糖基-L-高半胱氨酸、乳糖、核黄素和(R)-3-羟基丁酸酯）代谢物在脱脂乳中高，推测22种化合物的合成在L.casei Zhang VBNC态复苏过程中起关键作用，也表明了液体MRS培养基的复苏效果好于脱脂乳。该研究为L.casei Zhang VBNC态的复苏机理提供参考。