安徽甘蓝菌核病菌的致病力及其对3种杀菌剂的敏感性

张华蕊 夏智杰 宋江华 张立新*

（1 安徽农业大学植物保护学院，作物有害生物综合治理安徽省重点实验室，安徽合肥 230036；2 安徽农业大学园艺学院，安徽合肥 230036）

甘蓝（Brassica oleraceavar.capitataL.）是我国重要的蔬菜作物，营养丰富，适应性及抗逆性均较强，在全国各地普遍种植（杨丽梅 等，2021；杨丽梅和方智远，2022）。菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorium）引起的真菌性病害，在甘蓝全生育期均可发生，发病初期产生水渍状、淡褐色病斑，湿度较大时病部出现白色絮状菌丝，可见黑色鼠粪状菌核；一般导致甘蓝减产5%～20%，受害严重的地块减产可达50%以上，经济损失严重（杜磊和杨潇湘，2016）。菌核病菌的寄主范围非常广泛，除了危害十字花科蔬菜以外，还可侵害茄科、豆科、葫芦科等作物。据统计，核盘菌现已危害的植物有75 科408 种（刘佳 等，2016）。有研究表明，核盘菌种群内存在致病性分化（孙叶烁等，2019）。国内外对核盘菌致病力研究的报道多集中于油菜、向日葵和花椰菜等寄主植物（李沛利和叶华智，2006；孙溶溶 等，2011；许大凤 等，2014），在甘蓝上的研究鲜见报道。

近年来，安徽省甘蓝产区菌核病的发生呈现上升趋势，危害越来越严重。目前，化学防治仍是防治菌核病的主要措施，常用的杀菌剂为苯并咪唑氨基甲酸酯类杀菌剂、二甲酰亚胺类杀菌剂和琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂。然而，部分地区已发现核盘菌对常用杀菌剂产生了不同程度的抗药性（齐永霞 等，2006；匡静 等，2011；乔广行 等，2014；杨利娟 等，2020）。本试验对安徽淮南甘蓝主产区的菌核病菌进行了分离和致病力测定，并对3 种常用杀菌剂进行了敏感性评估，以期为甘蓝菌核病的综合治理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试甘蓝品种 京丰1 号、钢头50、精选争春、日本夏冠，购自河北省邢台市大力种苗有限公司；超级春丰，购自邢台甘之都种业有限公司；方震紫甘蓝，购自郑州方震种子有限公司；中甘11号，购自河北省邢台市兴达种业有限公司；绿玉，购自浙江神良种业有限公司；博春，由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。

1.1.2 供试药剂 40%菌核净可湿性粉剂，购自江西禾益化工股份有限公司；97%多菌灵原药，购自先正达作物保护有限公司；50%啶酰菌胺水分散粒剂，购自巴斯夫植物保护（江苏）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离 2020—2021 年从安徽省甘蓝主产区（怀远县和寿县）的4 个菌核病发生地块采集病株，采用组织分离法（张佳环 等，2015）进行病原菌分离。切取发病组织病健交界处，经75%酒精表面消毒15～30 s，0.1%升汞消毒90 s 后，无菌水洗涤3 次，然后置于PDA 平板，25 ℃黑暗培养；待菌落长出后进行纯化、保存。分离获得的菌株按地区来源编号，来自怀远县的记为HY，来自寿县的记为SX。

将分离纯化后的菌株分别接种于PDA 平板上，25 ℃黑暗培养，观察并记录菌落形态特征，对分离物进行形态学鉴定（刘婷婷 等，2016）。

1.2.2 病原菌的致病力测定 2021 年于安徽农业大学温室内种植参试9 个甘蓝品种，在直径为12 cm 的塑料花盆中装入育苗基质（购自淮安市中禾农业科技开发有限公司），每盆1 株。幼苗4～6 叶期，选取健康、完整且相近叶龄的叶片采用菌丝圆片活体接种法进行接种。使用直径为5 mm 的打孔器在培养2 d 的病原菌菌落边缘打取菌饼，将带有菌丝的一面贴到叶片顶端距主叶脉2 cm 处；每株菌株每个品种接种3 株幼苗，每株接种3 片叶片，以接种琼脂块为对照。然后，置于人工气候箱（25℃，相对湿度90%，12 h/12 h 光暗交替）内，第5天调查植株发病情况，病情分级标准参考姚星伟等（2018）的方法。0 级，无明显症状；1 级，发病叶片病斑面积占叶片面积的10%以下；2 级，发病叶片病斑面积占叶片面积的11%～30%；3 级，发病叶片病斑面积占叶片面积的31%～50%；4 级，发病叶片病斑面积占叶片面积的51%以上。

病情指数=∑（各级病叶数×相应级值）／（调查总叶数×最高级值）× 100

根据病情指数判定菌株的致病力，病情指数≤30，为弱致病力（WP）；30 ＜病情指数≤ 70，为中等致病力（MP）；病情指数＞ 70，为强致病力（HP）（孙溶溶 等，2011；姚星伟 等，2018）。

1.2.3 甘蓝菌核病菌对杀菌剂的敏感性试验 采用菌丝生长速率法测定不同来源的代表性菌株对3 种杀菌剂的敏感性。利用丙酮将多菌灵配制成浓度为1 000 μg·mL-1母液，利用无菌水将菌核净和啶酰菌胺配制成浓度为1 000 μg·mL-1母液，分别加入PDA 培养基中制成含药培养基，使多菌灵的终浓度分别为0、0.01、0.05、0.25、0.50、1.00 μg·mL-1，菌核净的终浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.10、0.50 μg·mL-1，啶酰菌胺的终浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 μg·mL-1；以等量不含药剂的丙酮或无菌水加入PDA 培养基作为对照，每处理3 次重复，每重复4 皿。使用内径为3 mm 的打孔器在培养3 d 后的病原菌菌落边缘打取菌饼，分别接种到含药PDA 培养基上，置于25 ℃培养箱中黑暗培养3 d，采用十字交叉法测定菌落直径，计算菌丝生长抑制率。

菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）／（对照菌落直径-3 mm）× 100%

使用DPS 7.05 软件计算抑制中浓度（EC50）和毒力回归方程，并进行卡方检验。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离纯化

对采集的甘蓝菌核病病株（图1-a）进行病原菌分离，共得到24 株菌株，其中怀远县纯化得到15 株，寿县得到9 株。所有分离获得的菌株形态一致，25 ℃培养条件下，PDA 平板上病原菌菌丝呈白色，菌丝稀薄，3 d 后菌落基本长满整个平板；5 d 后PDA 平板的边缘菌丝聚集，开始形成突起，初期为白色，较小，随后逐渐膨大，且在突出部位上出现水珠；7 d 后突起的颜色逐渐加深，直至变成黑色菌核，成环状排列，菌核形状为圆形、椭圆形及不规则形（图1-b）。

图1 甘蓝菌核病的田间症状及其病原菌的菌落形态

2.2 甘蓝菌核病菌的致病力测定

采用菌丝圆片活体接种法测定了24 株菌株在9 个甘蓝品种上的致病力，接种后发病病斑与采样病株田间发病症状一致，呈椭圆形、近圆形水渍状褐色病斑，病健交界明显，对照叶片均未发病；采集分离9 个甘蓝品种的病原菌与原接种菌株形态相同。这表明从田间甘蓝发病部位分离得到的菌株为甘蓝菌核病病原菌。

由表1 可以看出，安徽省甘蓝菌核病菌的致病力表现出明显差异。不同菌株对同一甘蓝品种的致病力不同，如博春接种不同菌株后，11 株菌株表现为强致病力，1 株菌株表现为中等致病力，剩余菌株表现为弱致病力甚至未能引起该品种发病。同一地区内的菌株致病力也存在明显差异，供试甘蓝品种接种来自怀远县的菌株HY4-3 的病情指数为66.67～100.00，而接种同来自怀远县的菌株HY6-3的病情指数仅为0～33.33；对于来自寿县的菌株，接种SXG12 的病情指数为8.33～100.00，而接种SXG8 的病情指数为0～25.00。这表明菌株的致病性分化与地理来源无明显相关性。

表1 甘蓝菌核病菌对不同甘蓝品种的致病性

2.3 甘蓝菌核病菌对3 种杀菌剂的敏感性

2.3.1 对菌核净的敏感性 由表2 可知，参试甘蓝菌核病菌菌株对菌核净的EC50值范围为0.055 4～0.137 7 μg·mL-1；其中，菌株HY4-3 的EC50值最大，是EC50值最小的菌株SXG1 的2.49倍。参考匡静等（2011）、乔广行等（2014）的标准，当EC50值小于5.0 μg·mL-1，则认为菌株对药剂具有敏感性。表明本试验中的参试菌株对菌核净较敏感。

表2 甘蓝菌核病菌对菌核净的敏感性

2.3.2 对多菌灵的敏感性 由表3 可知，参试甘蓝菌核病菌菌株对多菌灵的EC50值范围为0.037 1～0.104 2 μg·mL-1；其中，菌株SXG12 的EC50值最大，是EC50值最小的菌株SXG8 的2.81倍。表明参试菌株对多菌灵较敏感。

表3 甘蓝菌核病菌对多菌灵的敏感性

2.3.3 对啶酰菌胺的敏感性 由表4 可知，参试甘蓝菌核病菌菌株对菌核净啶酰菌胺的EC50值范围为0.074 4～0.187 0 μg·mL-1；其中，菌株HY4-1的EC50值最大，是EC50值最小的菌株SXG3 的2.51倍。表明参试菌株对啶酰菌胺较敏感。

表4 甘蓝菌核病菌对啶酰菌胺的敏感性

3 结论与讨论

本试验采用菌丝圆片活体接种法测定了来自安徽省2 个地区的24 株甘蓝菌核病菌菌株对9 个甘蓝品种的致病力，结果显示安徽省甘蓝菌核病菌的致病力表现出明显差异，不同菌株对同一甘蓝品种的致病力不同，同一地区内的菌株致病力也存在明显差异，但菌株的致病性分化与地理来源无明显相关性。李沛利和叶华智（2006）在对油菜菌核病菌致病性分化研究时发现，油菜菌核病菌致病性存在强弱差异，致病性分化与寄主来源关系不大；刘佳等（2016）对黑龙江地区向日葵菌核病菌致病性分化研究表明，不同菌株之间致病力存在显著差异，测试菌株与地理来源无明显联系，这与本试验中发现的甘蓝菌核病菌菌株的致病性分化与来源地区无关趋于一致。另外，本试验中参试的甘蓝品种大多数为目前安徽地区推广的品种，对菌核病的抗病性信息不明，今后仍需进一步开展不同甘蓝品种对菌核病的抗性筛选，以及甘蓝菌核病菌的致病力差异分析。

多菌灵属于苯并咪唑类杀菌剂，因其杀菌谱广、内吸性强、防病效果好而得到广泛应用，但其作用位点单一，容易使病原菌产生抗药性。目前已有安徽、北京、江苏等地区报道油菜等作物的菌核病菌对多菌灵产生了抗药性（齐永霞 等，2006；匡静 等，2011；乔广行 等，2014）。菌核净属于二甲酰亚胺类杀菌剂，已被广泛应用于控制油菜菌核病，但随着该药剂的推广使用，部分地区的油菜菌核病菌逐渐出现抗药性（石志琦 等，2000）。啶酰菌胺是目前使用范围最广、用量最大的琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂，天津地区报道蔬菜菌核病菌对啶酰菌胺出现了抗药性（杨利娟 等，2020）。本试验采用菌丝生长速率法测定了安徽甘蓝菌核病菌代表性菌株对多菌灵、菌核净和啶酰菌胺的敏感性，结果发现参试菌株对3 种杀菌剂的敏感性均较高，未发现有抗药性的菌株；其中对多菌灵敏感性最高，EC50值范围为0.037 1～0.104 2 μg·mL-1；对菌核净和啶酰菌胺的EC50值分别为0.055 4～0.137 7 μg·mL-1和0.074 4～0.187 0 μg·mL-1。这表明当前安徽省甘蓝菌核病菌还未对常规杀菌剂产生抗药性，建议在生产上使用多菌灵时与其他杀菌剂搭配使用，能够有效控制甘蓝菌核病。