分子标记技术在花椰菜品种鉴定上的应用研究进展

宋晓玉 甘德芳 杨 琳 宋顺华 孟淑春*

〔1 安徽农业大学园艺学院，安徽合肥 230036；2 北京市农林科学院蔬菜研究所，农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，农业农村部都市农业（北方）重点实验室，北京 100097；3 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081〕

随着我国蔬菜种子产业的高速发展，越来越多的新品种涌入市场，同时也出现了种子掺假销售、品种混杂以及同名异物、同物异名等现象。调查发现，假种子在生产过程中可能会出现产量低、长势弱、产品品质下降等问题，使蔬菜产品经济价值降低，种子市场紊乱，严重影响了蔬菜种子的生产、销售和种业发展。因此，进行品种鉴定，打击假冒伪劣种子，是保障种子质量，减少农户经济损失以及维护种子市场秩序的重要举措。

花椰菜（Brassica oleraceaL.var.botrytisL.）属于十字花科芸薹属，由欧洲野生甘蓝演变而来（王冬梅，2011），起源于地中海沿岸，在我国各地均有种植，是重要的蔬菜作物之一。当前，我国已成为花椰菜种植面积最大的国家（单晓政等，2019），其中栽培面积较大的有山东、河南、甘肃、福建、广东、浙江、上海、天津等地（朱焕焕，2019）。花椰菜外形美观、风味鲜美，具有极高的营养价值，其富含的钾元素可有效预防心血管疾病的发生（丁云花 等，2016）。花椰菜还含有蛋白质、碳水化合物、VC、多酚、类黄酮、莱菔硫烷等，丁燕等（2021）和陈敏氡等（2022）研究发现长期食用花椰菜可以降低癌症发生的机率。花椰菜品种主要以一代杂种的形式存在，具有生活力高、适应性强、品质优良等优点，但不可避免也会伴随杂交种不纯的现象产生。从种子生产过程来看，花椰菜杂交种的生产多是通过自交不亲和系来繁育（赵振卿 等，2016），在繁育、采收以及加工过程可能混入其他基因型的种子而造成种子混杂，影响杂交种种子的纯度（王梦梦 等，2022），进而造成生产损失。不仅如此，由于种子市场存在套牌、假冒的情况，品种侵权问题比较突出，对正规种子企业的切身利益产生负面影响，同时也给农民增收和农业经济发展带来无法估量的损失，因此开展花椰菜品种鉴定迫在眉睫。

传统的形态学鉴别方法虽然存在一定的局限性，费工费时，易受外界环境因素影响，但是该方法相对简易、直观，在品种鉴定中仍然被广泛采用且发挥重要作用（林珲 等，2012）。生化标记鉴定技术受环境因子影响小，已广泛应用于玉米、水稻、麦类等粮食作物，且对多种蔬菜作物亦成功进行了品种鉴定，如辣椒、豌豆、番茄、大白菜、茄子等（周金蒙，2015），但利用生化标记技术对花椰菜进行品种鉴定的相关研究鲜有报道。生化标记虽能克服传统形态学鉴别方法的缺点，但是多态性较低、稳定性较差，且不适合亲缘关系近的品种鉴定（孙秀霞 等，2017），因此无法满足种质资源鉴定和育种工作发展的需要。随着DNA 分子标记技术的迅猛发展，根据物种之间遗传物质DNA 的差异进行品种鉴定成为可能，并且取得显著成效。DNA 分子标记技术逐步克服了传统品种鉴定方法的不足，且不受环境因素和生长发育阶段的影响，具有高效、快速、稳定、准确、经济等优点，已在粮食作物、果树、蔬菜、花卉等作物的品种鉴定中广泛应用。本文对常用的分子标记技术主要包括RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）、RAPD（random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）、SSR（simple sequence repeat，简单重复序列）、ISSR（inter-simple sequence repeat，简单序列重复区间扩增多态性）、SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）等，以及新发展起来的InDel（insertion-deletion length polymorphism，插入缺失长度多态性）和DNA 条形码（DNA barcoding）在品种鉴定方面的研究进展进行了综述，以期为花椰菜品种鉴定技术的选择提供参考依据。

1 常用分子标记技术比较

DNA 分子标记技术主要分为三大类，第一类是以Southern 杂交为核心技术的分子标记，其中以RFLP 为代表；第二类是以PCR 扩增技术为基础发展起来的分子标记，常见的有RAPD、AFLP、ISSR、SSR 等；第三类主要是基于高通量测序和DNA 芯片技术的分子标记，包括SNP 等。不同类型的分子标记各有优势和不足（表1），RFLP、RAPD、AFLP 丰富度高，但是多态性表现为中等；SSR、SNP 多态性水平高；RFLP、AFLP、SSR、SNP 重复性好，其中RFLP、AFLP、SNP 对DNA 质量要求高；RFLP、SSR、SNP 为共显性标记，且辅助选择效率较好；RFLP、SNP 对技术要求高，故成本也高。

表1 常用DNA 分子标记技术比较

随着DNA 分子标记技术的普及应用，RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SNP 等技术已经广泛应用到蔬菜、果树、粮食作物、药用植物以及园林植物的品种鉴定、遗传连锁图谱构建、遗传多样性分析、基因定位等研究中。其中，SSR 和SNP 技术在农作物品种鉴定中的应用最为广泛，RFLP、AFLP、ISSR 以及DNA 条形码技术在药用植物鉴定中较常见。在过去很长一段时间内，RAPD 技术在十字花科作物研究中的应用最多，随着分子标记技术的发展，ISSR、SSR、SNP 等技术已经替代了RAPD 技术，广泛应用于十字花科蔬菜的品种鉴定、DNA 指纹图谱构建、亲缘关系与遗传多样性分析、基因定位等领域。

2 国内外花椰菜品种鉴定技术

2.1 RFLP 技术

RFLP 是以Southern 杂交技术为基础，将DNA 样品的酶切片段与特异性探针杂交结合，根据DNA 探针的不同呈现出多态性从而达到品种鉴定的目的。RFLP 是最早开发的一款分子标记鉴定技术（Grover &Sharma，2016），已在玉米、小麦、辣椒、番茄等作物上成功应用（朱小涛，2018）。但由于其操作技术难度大、成本高，对DNA 多态性检出的灵敏度较低，且在试验过程中需要使用放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不利于自动化，导致应用受到限制，在花椰菜品种鉴定方面应用较少。

2.2 RAPD 技术

RAPD 是以PCR 扩增技术为基础，基因组DNA 为模板，人工合成的单链引物为原料，使DNA 链扩增，扩增产物通过凝胶电泳技术进行检测。众多学者利用RAPD 技术对甘蓝、辣椒、番茄、花椰菜、南瓜等蔬菜作物进行了品种鉴定研究，获得了理想的试验结果（刘子记等，2013）。RAPD 技术操作简单、DNA 用量少、检测速度快、成本低，已在花椰菜亲缘关系研究、遗传距离判断以及品种鉴定等领域普遍应用。Astarini 等（2004）利用RAPD 技术对25 个花椰菜栽培品种的亲缘关系进行分析，其中18 个样本属于不同品种，另外7 个样本中的Donner 和SPS3074 属于同一品种，认为RAPD 技术可有效区分同物异名现象。在此基础上，Astarini 等（2006）利用4 个RAPD 引物成功区分了6 个花椰菜品种，再次证实了RAPD 技术可有效区分花椰菜种质。遗传多样性研究对花椰菜种质资源的收集、保存和利用具有重要意义。林珲（2007）和陈阳（2010）先后对花椰菜品种的遗传多样性进行分析，进一步证明了RAPD 技术对于花椰菜遗传多样性研究的可行性。综上所述，RAPD技术虽然适用于花椰菜种质鉴定和遗传多样性分析，但是由于其显性遗传的特性，不能识别杂合子，且存在共迁移问题，只有不同长度DNA 片段能够被凝胶电泳区分，而无法分离那些分子量相同但碱基序列不同的DNA 片段（刘丽华，2010）。除此以外，RAPD 技术对于反应条件极为敏感，试验的稳定性和重复性都较低，在选择合适的花椰菜品种鉴定技术时，这些不利因素均需考虑在内。

2.3 AFLP 技术

AFLP 是将RFLP 与PCR 技术相结合，兼具RFLP 和RAPD 技术的优点，具有较高的稳定性，且通过少量高效的引物组合即可获得覆盖整个基因组的AFLP 标记。AFLP 技术在进行花椰菜品种鉴定时既保证了可靠性，又维持了灵敏性。Seyis 等（2003）利用3 对AFLP 引物组合对源自印度黄油菜与5 个花椰菜品种杂交产生的165 个RS 油菜品系进行分析，共获得467 条多态性条带，表明RS系品种遗传差异性较大，较容易被区分，该研究结果对花椰菜新品种选育和鉴定具有重大意义。古瑜等（2007）利用AFLP 和NBS profiling 技术鉴定花椰菜F2分离群体，成功构建了第1 个花椰菜遗传连锁图谱，表明AFLP 技术适用于花椰菜品种的遗传多样性分析。EI-Esawi 等（2016）利用AFLP 分子标记对包括花椰菜在内的25 份芸薹属材料进行遗传多样性分析，11 对引物共扩增出471 个AFLP片段，其中423 个具有多态性，引物多态率高达90%，可以成功区分25 份参试材料。以上研究结果均表明，AFLP 技术不仅能对高代自交系进行遗传多样性分析鉴定，还能对不同品种杂交产生的品系和品种间的遗传亲缘关系进行验证，从而选择亲缘关系远、遗传差异大的材料作为亲本，通过杂种优势将优良基因转移到栽培种中，为新种质创制提供选择依据。作为一种高效的鉴定技术，AFLP 具有多态性较好、稳定性高等优点，已在花椰菜遗传育种、遗传多样性分析中发挥其优势。但AFLP 技术对基因组DNA 纯度、内切酶的质量和反应条件要求高；用于遗传作图时，少数标记与图谱遗传连锁度存在偏差，使得该技术在遗传连锁图谱构建方面的普及应用受到限制。

2.4 SSR 技术

SSR 又名微卫星DNA，通常存在于真核生物体中，是一类由1～6 个核苷酸组成的短串联序列，由于SSR 中每个碱基的串联重复数目不同以及重复单位数目的高度变异，故其具有丰富的多态性，有利于进行快速品种鉴定（杨梦婷等，2019）。在进行花椰菜品种鉴定时，可以先根据SSR 侧翼序列的高度保守性设计引物，再利用PCR 技术进行目的片段的扩增，最后通过凝胶电泳技术检测扩增产物，获得含有目的条带的电泳图，并根据电泳图上的条带有无和数量多少来确定SSR 引物扩增的结果（杨金雪，2014；赵雅楠等，2015）。SSR 标记不仅能够鉴定杂合体和纯合体，而且结果可靠、方法简单、省时省力，已经广泛应用在花椰菜品种鉴定、分子标记辅助育种、基因定位和遗传多样性分析等领域。Ram 等（2016）利用SSR 引物BoGMS1041 产生的特异性位点，成功将花椰菜品种Sel-26 和Suprimax Late 区分开来。Pattanaik 等（2018）根据SSR 引物具有共显性标记的特点，筛选出共显性SSR 标记BrgMS565，成功鉴别出花椰菜杂交种中存在的亲本株和异品种株。诸云霞等（2020）同样利用SSR 标记成功鉴定了109 个花椰菜品种。综上所述，针对花椰菜品种鉴定，SSR 分子标记是一项高效、稳定的技术。Verma 等（2017）利用SSR 和RAPD 技术鉴定花椰菜种质，成功区分开早熟和中熟花椰菜品种，并且根据鉴定结果可以推测出最优的花椰菜品种杂交组合，为花椰菜良种繁育提供了技术支持。SSR 技术不仅应用于花椰菜品种鉴定和育种方面，在遗传多样性分析中亦有广泛应用。Rakshita 等（2021）以92 个花椰菜品种、2 个甘蓝品种和2 个青花菜品种为试材，利用90 对多态性高的SSR 引物进行遗传多样性分析，通过聚类分析对参试材料间的亲缘关系进行判断，根据亲缘关系的远近可以有效区分这96 份材料。刘春晴等（2018）和Zhu 等（2018）利用SSR技术对花椰菜材料进行遗传多样性研究，并进行聚类分析，二者都证实了花椰菜遗传多样性与成熟度相关。由此可见，通过遗传关系的分析，判断不同花椰菜品种之间的遗传距离，进而评价品种之间的异质性，是选择优势品种的依据。

2.5 ISSR 技术

ISSR 是基于SSR 技术发展而来的一种新型标记技术。该技术根据SSR 序列本身来设计引物，即在SSR 引物序列的一端插入2～4 个任意核苷酸，克服了SSR 标记应用时需要对研究材料进行DNA 测序的不足。ISSR 标记分布广泛，进化变异速度快，具有很好的稳定性和多态性，在花椰菜品种鉴定中已有少量应用。马二磊等（2010）利用1对ISSR引物NAUISR42区分开了9个花椰菜品种，证实ISSR 标记可用于花椰菜品种鉴定。在进行花椰菜新品种选育研究中，陶兴林（2017）成功筛选出与花椰菜温敏雄性不育基因连锁的ISSR 分子标记，该研究成果加快了杂交花椰菜新品种选育的进程。ISSR 技术不仅应用于品种鉴定及新品种选育，在筛选抗病基因中同样发挥重要作用。Saha 等（2014）利用RAPD、ISSR 和SSR 技术对花椰菜F2抗黑腐病群体和易感黑腐病群体进行分析，成功筛选出抗性植株；此外，RAPD 技术与ISSR 技术结合可提高抗黑腐病花椰菜品种选择的准确性。Singh 等（2015）以高品质易感霜霉病和低品质抗霜霉病花椰菜的杂交品种为材料，利用6 个RAPD多态性标记和7 个ISSR 多态性标记成功定位花椰菜基因组中抗霜霉病基因Ppa3。虽然ISSR 技术已被证实可用于品种鉴定、抗病种质筛选等研究中，但是由于其通常为显性标记，无法准确区分检测位点的杂合与纯合，因此未能在生产上广泛应用。

2.6 SNP 技术

SNP 是指基因组中单个核苷酸的突变导致DNA 分子序列发生变化，从而具有多态性。SNP标记是当前用于检测种内个体间遗传变异的分子单位最小的技术（李贝贝 等，2017），具有数量多、稳定性好、分布广泛等优点。SNP 技术已经应用于基因分型、基因定位、高密度遗传连锁图谱构建、分子标记辅助育种等领域（Heet al.，2014；Yang et al.，2020）。赵振卿等（2019）找到一种与花椰菜花球毛花性状连锁的SNP 位点，设计引物并成功区分出不同花球性状的花椰菜品种，该方法可在苗期对花椰菜材料进行检测，淘汰含有易毛花基因型的材料，大幅度减少花椰菜种植过程中的田间管理和表型鉴定的工作量。盛小光等（2020）开发了一种用于鉴别浙农松花80 天的SNP 引物，采用KASP 标记技术，成功鉴定208 份花椰菜材料的纯度，鉴定结果与形态学检测的结果完全一致，充分证明了该研究方法在花椰菜品种纯度鉴定中的可靠性。Yousef 等（2018）开发SNP 标记用于191 份花椰菜材料的遗传多样性分析，结果表明花椰菜品种的亲缘关系远近与产地相关。

DNA 基因芯片技术是SNP 标记的检测方法之一。基因芯片中分布大量的DNA 探针，这些探针可与目标DNA 产生特异性反应，进而筛选出众多SNP 位点，具有快速性、高通量、自动化等优势（王端莹，2017）。基因芯片技术已经在水稻、小麦、玉米、大豆、马铃薯、番茄等作物中逐渐得到应用（Bayer et al.，2017）。在芸薹属蔬菜作物中，目前已经开发出油菜高密度Illumina Infinium（60 K）基因芯片，其中包含52 157 个SNP 位点，在油菜遗传图谱构建、全基因组关联分析和重要质量性状的QTL 定位等方面得到有效的应用（周龙华和蒋立希，2016）。高通量检测是基因芯片技术的一大优势，即一次可以对多个SNP 位点进行规模性筛选，大大提高了检测效率，并且有利于实现分析的自动化，适用于快速、规模化筛查（苏瑞 等，2019）。进行SNP 检测的方法有很多，其中最佳方法是基因芯片技术，但是需要进行大量的生物信息学分析，然后设计引物、扩增测序。基因芯片设计成本高，技术难度大，测序复杂，故SNP 标记的开发和应用在花椰菜品种鉴定方面目前还处于初级阶段，尚未得到普遍应用。

2.7 InDel 技术

随着新一代转录组测序技术的快速发展，针对已有参考序列的物种，对其进行全基因组重测序，可发现大量插入缺失位点。InDel 是基于全基因组测序技术的第3 代分子标记，指在近缘种或同种不同个体之间基因组的同一位点插入或者缺失不同大小的核酸片段（吴鑫燕 等，2021）。InDel 标记在基因组中分布广泛，开发成本低，利用琼脂糖凝胶电泳即可进行试验操作。目前在水稻（Moonsap et al.，2019）、大豆（陈正杰 等，2021）、辣椒（Guo et al.，2019）、茄子（吉康娜 等，2019）等作物中均有研究，同时在大白菜（薛银鸽 等，2014）、甘蓝型油菜（倪西源 等，2020）、普通白菜（青梗菜）（王群 等，2021）、花椰菜（王梦梦 等，2022）等十字花科蔬菜作物中亦有应用。王梦梦等（2022）基于花椰菜品种津品70 的两个亲本自交系的重测序，开发InDel 标记成功用于津品70 品种真实性鉴定以及纯度鉴定；并构建了16 个花椰菜杂交种的数字核酸指纹图谱，为花椰菜种质资源鉴定提供了重要的技术支持。吴鑫燕等（2021）依据BSA重测序对花椰菜中松花性状进行基因定位，开发出2 个InDel 连锁标记，均能区分出F2分离群体中的极端松花类型和极端紧花类型，该研究为花椰菜杂交育种亲本及组合的选配提供了参考依据。张小丽等（2022）利用InDel 标记成功筛选出与白色花椰菜花球变紫性状连锁的InDel 标记，该标记在幼苗期即可进行花球不变紫的花椰菜种质资源筛选和鉴定。但是InDel 技术也存在自身的限制，由于一些非模式作物基因组测序尚未完成，导致开发InDel标记存在一些困难，使其应用也受到一定影响（杨洁 等，2016）。

2.8 DNA 条形码技术

DNA 条形码是利用较短的标准DNA 片段快速准确的识别动植物群体（Gogoi &Bhau，2018），且在种内具有稳定的保守性，在种间具有丰富的遗传变异多样性。已有大量研究表明该技术广泛应用于动物、药用植物、真菌等物种的鉴别（杨倩倩 等，2018）。DNA 条形码技术发展至今已建立了较为完善的生命条形码数据系统（barcode of life database system，BOLD），根据BOLD 数据库网站（http：//www.barcodinglife.org）报道，目前已经收录了包含动物、植物、真菌在内的9 971 821 条DNA条形码。DNA条形码作为一种新的鉴定技术，操作方便快捷，准确性高，使用样本量少，可用于大量品种的鉴别，在很大程度上弥补了传统鉴定技术的不足，且不局限于物种形态特征和生长发育阶段，在没有分类学的基础下也可以进行很好的识别（Song et al.，2016）。但需要重视的是，该技术对试验操作过程要求严格，DNA 质量要求高，如若在DNA 提取和PCR 反应试验过程中造成DNA 污染，则可能会使DNA 条形码产生虚假识别（Yang et al.，2017）。

3 SSR 分子标记在花椰菜品种鉴定中存在的问题及解决办法

综合分析各分子标记技术在花椰菜品种鉴定中的应用研究，SSR 技术表现出独特的优越性，具有多态性丰富、重复性好、辅助选择效率高等优势，且为共显性标记，对于DNA 质量和操作技术要求不高。但是，在利用SSR 技术进行花椰菜品种鉴定的过程中也发现一些问题，建议采用相应办法解决。

利用SSR 技术鉴定花椰菜品种时需要筛选出多态性丰富的核心引物，该过程耗时过长，并且需要通过大量材料对核心引物的可行性进行佐证，因此缩短引物筛选时间并筛选出多态性丰富的核心引物是进行花椰菜品种鉴定的关键所在。筛选引物时应选择表型性状差异大的品种作为鉴定材料，并且设计合适的筛选条件。另外，在进行花椰菜品种鉴定数据分析过程中，根据指纹图谱检测种子基因型的位点差异存在片面性，鉴定结果只能说明SSR标记位点相同，不能排除未检测到的位点存在差异，应尽可能构建完整的花椰菜品种指纹图谱库或者给定品种范围进行检测鉴定。

盛小光等（2019）采用30 对SSR 引物对187份花椰菜、青花菜材料进行遗传多样性分析，扩增出313 个等位位点，根据花球性状可以将这187 份材料分成4 类，根据等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon’s 指数等指标分析得出花椰菜类群的遗传差异较小。Zhao 等（2016）利用SSR 技术分析不同花椰菜品种间的遗传多样性，结果表明花椰菜品种的遗传背景差异较小，遗传多样性狭窄，难以用分子标记进行区分。因此对遗传背景相似的花椰菜品种进行精准区分亟待解决，可选择遗传背景远且性状有明显差异的花椰菜品种用于SSR 引物的多态性筛选，同时可与其他分子标记技术结合进行花椰菜品种的区分。

4 小结

我国是花椰菜种植面积最大且种质资源最为丰富的国家。随着市场对于花椰菜的需求与日俱增，不法分子制售伪劣种子等违法行为愈加猖獗，在很大程度上限制了花椰菜种业的发展。因此，利用分子标记技术构建花椰菜指纹图谱，进行花椰菜品种鉴定刻不容缓。本文对于当前常用的几种分子标记技术在花椰菜上的应用研究进行了概述，综合比较结果表明SSR 技术优势明显，具有一定的应用前景与推广价值。但随着分子生物学的快速发展，DNA 分子标记技术仍需要与更多的研究及新技术结合加以完善。为了提高花椰菜品种鉴定效率，利用高通量测序技术开发更多微卫星标记，构建花椰菜DNA 指纹图谱数据库。同时将花椰菜DNA 指纹数据录入到互联网中，并且实时补充新的指纹数据，完善花椰菜指纹图谱，进行不同实验室之间的数据共享，从而实现快速鉴定花椰菜品种的目的。不仅如此，健全关于花椰菜品种鉴定的行业标准迫在眉睫，还应建立规范化种子生产指标，从源头治理种子伪劣问题，加大种子执法力度，确保花椰菜产业健康可持续发展。