基于UPLC-Q-TOF/MS技术结合序贯代谢法研究诃子汤炮制草乌机理＊

策力木格，许 良，松 林，图 雅

（1.内蒙古民族大学蒙医药学院 通辽 028000；2.内蒙古民族大学化学与材料学院 通辽 028000；3.内蒙古医科大学蒙医药学院 呼和浩特 010110；4.中国中医科学院中医药研发中心 北京 100700）

草乌为毛茛科乌头属植物北乌头（Aconitμm kusnezoffii Reichb.）的干燥块根，蒙医理论认为草乌（蒙药名为泵阿）味辛、性温、效轻、有大毒、功能杀“粘”、止痛、燥“协日乌素”、多用于瘟、粘、关节“协日乌素”、风湿病、心“赫依”、牙痛等病[1]。现代研究表明草乌主要含生物碱类成分，其中双酯型二萜类生物碱，如乌头碱、新乌头碱、次乌头碱[2]，既是药效成分又是有毒成分，由于其治疗量与中毒量非常接近，因此用药不当容易产生毒副反应、导致严重心律失常、休克、甚至中毒致死[3]。因此，蒙医临床用草乌必须先炮制随后配伍入药应用。多年来蒙医临床上所采用的多种炮制方法能够做到既保证草乌有效性又能够降低其毒性。如酸奶炮制、童子尿泡制及诃子汤炮制等，其中诃子汤炮制草乌方法不仅操作简单且炮制效果好而得到广泛应用。但是目前国内外有关诃子汤炮制草乌机制的研究局限于定性定量分析草乌炮制品所含有毒（有效）成分[4-7]，而从草乌炮制品有毒（有效）成分口服吸收情况，或者炮制对草乌有毒（有效）成分口服吸收、消化道内的生物转化的影响的角度开展的相关研究较少。由于临床用药多数以配伍整体用药而并非单个成分应用，因此在研究诃子汤炮制草乌机理研究中将草乌中的多成分作为一个彼此相互联系的整体，研究其在体内代谢的相互影响是非常有必要的。鉴于此，本研究在前期工作中应用UPLC-Q-TOF/MS技术对生草乌、诃子汤炮制草乌药材化学成分及其经过吸收代谢入血成分进行了定性定量研究，结果显示经过诃子汤炮制草乌不仅对其化学成分有一定的影响，而且对其吸收代谢也有一定的影响。

因此本研究采用在体封闭肠环法结合高效液相色谱串联质谱技术对生草乌、制草乌、诃子依次进行肠壁吸收、肠道菌吸收代谢、肝代谢分段研究。比较生草乌、制草乌、诃子多成分具体吸收代谢点及不同吸收代谢位点吸收代谢量，以此探讨诃子汤炮制草乌机理，为今后进一步深入研究诃子汤炮制草乌的机理、代谢规律以及临床安全合理用药提供实验依据。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

草乌（湖北聚瑞中药饮片有限公司，批号：141001）经内蒙古医科大学蒙医药学院松林教授鉴定为毛茛科植物北乌头（Aconitµm KusnezoffiiReichb.）的干燥块根；对照品（所有对照均由INLUCK公司提供）：乌 头 碱(批 号：MUST-15013008)、次 乌 头 碱(批 号：MUST-15090918)、新乌头碱(批号：MUST-15091504)、苯甲酰乌头原碱（MUST-15012215）苯甲酰次乌头原碱（MUST-150108006）苯甲酰新乌头原碱（MUST-16012816）、塔拉萨敏（MUST-14111811）、次乌头原碱（MUST-14123010）、滇乌头碱（MUST-14110715）、草乌 甲 素（MUST-14100913）、硬 飞 燕 草 碱（MUST-14102105）、乌头原碱（MUST-14121101）、新乌头原碱（MUST-16030604）、高乌甲素（MUST-15030509）、宋果灵（MUST-16032515）、附子灵（MUST-15060810）、尼 奥 林（MUST-14052513）、多 根 乌 头 碱（MUST-15031213）、德 尔 塔 林（MUST-14091408）；乙 腈（HPLC-MS级，Fisher Scientific公司）；氨水（色谱纯，FluKa公司）；醋酸铵（色谱纯，DikmaPure公司）；乙醚（分析纯，国药集团化学试剂公司）；超纯水（自制）；诃子（仁和中药有限公司，批号：20140101）经内蒙古医科大学蒙医药学院松林教授鉴定为使君子科植物诃子Terminalia chebµlaRetz.的干燥成熟果实；对照品：柯里拉京（批号为：MUST-13051301）、异阿魏酸（批号为：MUST-13050201）、没食子酸（购自上海康标化学品有限公司）、安石榴磷（批号为：MUST-13061902）、鞣花酸（Chengdu Biopurify 636phytochemicals）、阿魏酸（批号为：MUST-12112204）、安石榴苷（批号为：MUST-13052405）；甲 醇（HPLC-MS级，Fisher Scientific公司）；冰醋酸(四平巨能药业有限公司)；乙醇（天津市风船化学试剂厂）；实验用水为自制去离子水；氯化钠（西陇化工股份有限公司，批号：100511）；氯化钾（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20100804）；氯化钙（北京试剂公司，批号：20111126）；碳酸氢钠（北京试剂公司，批号：20090227）、磷酸二氢钠（Japan.Batch，093k0096）；氯化镁（天津市福晨化学试剂厂，批号：20151220）；葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司，批号：20101229）；生理盐水、肝素钠（天津生物化学制药有限公司）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；医用胶（康派特，北京康派特医疗器械有限公司）；自制蒸馏水。

1.2 仪器与设备

UPLC I-CLASS超高效液相色谱仪；G2-SQTof质谱仪；Waters ACQUITY uplc-i-class系统（美国沃特斯公司）；十万分之一电子天平(美国MettlerToledo公司)；移 液 枪(美 国Rainin Instrµment公 司，10、100、200、1000µL)；超声波清洗器（上海必能信超声有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；低温冰箱（日本三洋公司）。

1.3 实验动物

清洁级SD大鼠，雄性，体重200±20 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可合格证号SYXK（京）2017-0033。饲养于符合国家标准的屏障环境中，室温22～24℃，相对湿度60%。实验前适应性喂养7天，自由饮水和进食。

1.4 诃子汤炮制草乌的制备

取生草乌：诃子为2∶1，加10倍量水煎煮1 h，4层纱布过滤，用滤液浸泡生草乌2天再煎煮8 h捞出，将草乌置于方盘中烘干（60℃）。

1.5 含药血浆的制备

1.5.1 Krebs-Ringer's营养液配制

称取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、葡萄糖1.40 g，加蒸馏水定容至1000 mL，调节pH为7.39-7.41，放置备用。

1.5.2实验药液的制备

取诃子、生草乌、制草乌粉末各100 g，用K-R营养液配制成含原药材分别0.16、0.0128、0.16 g/mL的溶液。

1.5.3序惯代谢实验操作

将135只SD雄性大鼠随机分为生草乌肠壁吸收手术组、肠道菌吸收代谢手术组、肝代谢手术组，制草乌肠壁吸收手术组、肠道菌吸收代谢手术组、肝代谢手术组，诃子肠壁吸收手术组、肠道菌吸收代谢手术组、肝代谢手术组。各组分别平行三组，每组5只。

（1）肠壁吸收实验

15只SD大鼠禁食12 h，自由饮水，分为2组，12只为供血组，3只为实验组。

15只大鼠全部腹腔注射水合氯醛麻醉，供血组腹主动脉取血放于肝素化管并置于37℃水浴锅中。实验组沿腹中线打开腹腔约3-4㎝选取空肠作为供试肠段，用少许生理盐水冲出肠内物，在肠段首末端系上丝线，用注射器将药液注入肠腔。当药液到达肠段末端，用丝线结扎。用37℃生理盐水浸润过的纱布盖住裸露的肠段，恒温板加热。大鼠颈静脉插管通过蠕动泵连接到从供血组取出的血液中给实验大鼠供血，同时结扎肝门静脉，肠系膜静脉收集血液1.5 h，放入肝素化的离心管中，4000 r/min离心10 min，取上清，-80℃冻存，备用。

（2）肠道菌吸收代谢实验

15只SD大鼠禁食12 h，自由饮水，分为2组，12只为供血组，3只为实验组。

15只大鼠全部腹腔注射水合氯醛麻醉，供血组腹主动脉取血放于肝素化管，置于37℃水浴锅中。实验组大鼠沿腹中线打开腹腔约3-4㎝选取结肠，在肠段首末端系上丝线，用注射器将药液注入肠腔。当药液到达肠段末端，用丝线结扎，然后取下注射器并结扎肠段前段。通过蠕动泵从颈静脉给实验鼠供血，蠕动泵另一端开始收集血液流速0.5 mL/min。同时结扎门静脉，待实验进行1.5 h后处死大鼠。收集的血液放入肝素化管中，4000 r/min离心10 min，取上清液，-80℃冻存，备用。

（3）肝代谢实验

肝代谢后多成分进入血液系统，因此需要主动脉插管手术，选取空肠与结肠两段灌药。不需要供血，不结扎门静脉，1.5 h后腹主动脉采血约10 mL，收集的血液放入肝素化离心管中，4000 r/min离心10 min，取上清液，-80℃冻存，备用。

1.6 含药血浆的检测

1.6.1生草乌、制草乌含药血浆的检测

血浆样品的处理：取200µL血浆加40µL氨水混悬1 min，再加入1 mL乙醚混悬5 min，10000 r/min离心10 min，取上清，氮气吹干，再加40 µL 70%乙腈复溶，进样检测。

色谱条件：采用ZOX Extend-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8µm），流动相10 mmol醋酸铵水溶液（氨水调pH为9.02）（A），乙腈（B），柱温40℃；进样量10 µL检测，洗脱时间梯度见表1。

表1 草乌含药血浆LC-MS检测洗脱时间梯度表

表1 诃子含药血浆LC-MS检测洗脱时间梯度表

质谱条件：毛细管电压：0.5 kV；锥孔采样电压：40 V；去溶剂气温度：450℃；去溶剂气流量：900（L/h）；锥形气体流量：50（L/h）；离子源温度：100℃；碰撞能量：使用自动碰撞能量（电子伏特）6；质量精度保持使用锁定喷雾与亮氨酸脑啡肽浓度在200µg/µL和流量10 µL/min作 为 参 考（m/z 556.2766 ESI（+）和554.2620-（-））；扫描方式为正离子扫描，质量扫描范围50～1200。

1.6.2诃子含药血浆的检测

血浆样品的处理：将1.4制备所得诃子样品血浆各取200µL血浆加600µL 70%乙醇，混悬沉淀蛋白，10000 r/min离心10 min，取上清，过0.22µm膜进样检测。

色谱条件：采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（50 mm×4.6 mm,1.8-Micron 600Bar），ZORBAX Eclipse Plus-C18预柱（12.5 mm×4.6 mm，5-Micron），流动相0.1%甲酸水溶液（A），0.1%甲酸甲醇（B），柱温30℃；进样量10µL检测，洗脱时间梯度见表2。

质谱条件：毛细管电压：2 kV；锥孔采样电压：30 V；去溶剂气温度：450℃；去溶剂气流量：900（L/h）；锥形气体流量：50（L/h）；离子源温度：100℃；碰撞能量：使用自动碰撞能量（电子伏特）6；质量精度保持使用锁定喷雾与亮氨酸脑啡肽浓度在200µg/µL和流量10 µL/min作 为 参 考（m/z 556.2766 ESI（+）和554.2620-（-））；扫描方式为负离子扫描，质量扫描范围50～1500。

2 结果与分析

2.1 样品图谱的采集

按照上述方法采集得到生草乌、制草乌、诃子色谱图如图1-3。

图1 肠壁吸收代谢实验LC-MS图

2.2 吸收代谢入血成分的鉴定与表征

2.2.1肠壁吸收代谢实验图谱解析与结果

利用MasslynxV4.1工作站中的“strip”工具，设定空白血浆样品图谱作为基线背景，输入含药血浆图谱进行处理去除血浆中内源性成分，得到含药血浆减去空白血浆的色谱图后再进斤进一步地手动排查确认，从而筛选出空白血浆中没有、含药血浆中有的色谱峰，推测草乌血中移行成分。将确定的将确定的血中移行成分的保留时间、精确分子质量、碎片离子等信息与本课题组前期实验草乌药材、诃子药材化学成分LC-MS鉴定的相关信息及参考文献[10-31]进行比对，相同的化合物即为草乌吸收入血的原型成分，在草乌药材供试品溶液图谱中没有被检测到的化合物，即为代谢产物。采用以上分析方法对肠壁吸收代谢样品所得图谱进行解析，结果在肠壁吸收含药血浆图谱中生草乌与制草乌共检测到32种血中移行成分，其中鉴定出共有成分16个，只在生草乌给药组检测到成分8个，只在制草乌检测到成分8个。未知成分生草乌与制草乌分别有3、2种，同时检测出1种共有未知成分，见表3。在诃子肠壁吸收含药血浆中共检测到17种化合物，其中10种成分是已知成分，有7种未知成分，见表4。

表3 草乌肠壁吸收代谢成分鉴定信息表

表4 诃子肠壁吸收代谢成分鉴定信息表

续表

续表

图2 肠道菌吸收代谢实验LC-MS图

图3 肝代谢实验LC-MS图

续表

2.2.2肠道菌吸收代谢实验图谱解析与结果

与肠壁吸收样品图谱解析相同的方法对肠道菌吸收代谢样品所得图谱进行解析，结果在肠道菌吸收代谢含药血浆图谱中草乌与制草乌共检测到31种血中移行成分，其中鉴定出共有成分10个，只在生草乌给药组检测到成分7个，鉴定出其中2种成分，只在制草乌检测到成分14个，其中鉴定出11种成分。未知成分生草乌与制草乌分别有5、3个，见表5。在诃子肠壁吸收含药血浆中共检测到13种化合物，其中10个成分已鉴定出，有3种未知成分，见表6。

表5 草乌肠道菌吸收代谢成分鉴定信息表

表6 诃子肠道菌吸收代谢成分鉴定信息表

2.2.3肝代谢实验图谱解析与结果

与肠壁吸收代谢样品图谱解析相同的方法对肝代谢所得样品图谱进行解析，结果在肝代谢含药血浆图谱中草乌与制草乌共检测到21种血中移行成分，其中鉴定出共有成分5个，只在生草乌给药组检测到成分7个，鉴定出其中4种成分，只在制草乌检测到成分9个，鉴定出其中5个成分。未知成分生草乌与制草乌分别有3、4个，见表7。在诃子肝代谢含药血浆中共检测到11种化合物，其中8个成分已鉴定出，有3种未知成分，见表8。

表7 草乌肝代谢成分鉴定信息表

表8 诃子肝代谢成分鉴定信息表

2.3 血浆中成分的鉴定示例

以化合物次乌头碱（保留时间为17.91）为例，与空白血浆相比，大鼠给药后含药血浆中检测到准分子离子峰m/z 616[M+H]+，在高碰撞能条件下将m/z 616进一步打粹，得到碎片离子主要有m/z 584.2803；m/z 556.2857；m/z 524.2646；m/z 496.2699；m/z 492.2385；m/z 338.1743与对照品检测图谱中及草乌药材化学成分图谱中化合物次乌头碱的保留时间及碎片离子一致，如图4因此推断该化合物为次乌头碱。

图4 次乌头碱碎片离子图A：对照品；B：药材；C：血浆

2.4 草乌与诃子各成分可能代谢位点研究

通过综合分析3个连续实验结果，将已鉴定出成分可能代谢位点一一列出，结果显示有些成分可在肠壁吸收，肠道菌吸收及肝代谢中均能检测到，如制草乌成分新乌头原碱，这说明制草乌中新乌头原碱可以原型成分吸收入血。而有些成分在肠壁及肠道菌吸收中检测到，而未在肝代谢中检测到，如制草乌成分别那宁，这说明制草乌中别拿宁有可能经过肝代谢转换成其他成分或者亦有可能代谢过程中被破坏。此外一些成分只在肠壁吸收中检测到，肠道菌与肝代谢中均无，如生草乌中乌头原碱、次乌头原碱等。也有些成分只在肠道菌吸收中检测到而肠壁吸收及肝代谢中均无，如制草乌中多根乌头碱。还有一些成分只在肝代谢中检测到，为未能在肠壁及肠道吸收中检测到，如生草乌中苯甲酰乌头原碱，见表9-11。这种吸收代谢原理均有待深入研究，相信通过揭示此吸收代谢原理可以为诃子汤炮制草乌机理研究提供更科学的依据。

表9 制草乌代谢成分可能代谢位点表

在成分鉴定的基础上，应用Masslynx V4.1工作站中的“targetlynx”工具对已鉴定出的成分进行相对峰面积计算。首先在“edit method”功能中编辑积分条件，然后选定所要进行积分图谱，计算出各个已鉴定出成分的相对峰面积，对生草乌、制草乌与诃子已知成分各个代谢位点代谢情况研究。结果如图5。

图5 已知成分各代谢位点代谢情况

由图可知，生草乌组多数成分在肠壁吸收中检测出，而肠道菌及肝脏代谢中检测到成分相对较少，而制草乌组肠壁吸收级肝脏代谢成分相对较少，而在肠道菌中相对较多，出现这种现象很有可能是因为经过诃子汤炮制草乌，使草乌中一些成分的代谢位点、代谢情况发生变化。相信经过深入研究亦可对诃子汤炮制草乌机理研究从另一种角度提供实验依据提供依据。

3 讨论

本研究以诃子汤炮制对草乌吸收代谢的影响为切入点提出假说：诃子汤炮制草乌的减毒效应与其吸收代谢有关，因此采用UPLC-Q-TOF/MS技术和封闭肠环法研究了炮制前后草乌成分在肠壁吸收、肠道菌及肝代谢的相关性，寻找两者不同吸收代谢部位的相同及不同的成分并进行了定性定量研究，从而探讨了诃子汤炮制草乌机理。

通过入血成分鉴定研究可知，在肠壁吸收研究中生草乌组、制草乌组共有成分16种，在肠道菌吸收代谢研究中检测出生草乌、制草乌组共有成分10种，在肝代谢研究中检测出生草乌组、制草乌组共有成分5种，在之后深入研究中此类成分可被遴选作为其质量控制成分；而肠壁吸收研究中只在生草乌组检测出而未在制草乌组检测到成分8种、只在制草乌组检测出而未在生草乌组检测出成分8种。在肠道菌吸收代谢研究中只在生草乌组检测出而未在制草乌组检测到成分7种、只在制草乌组检测到而未在生草乌组检测出成分15种。在肝代谢研究中只在生草乌组检测出而未在制草乌组检测到成分7种、只在制草乌组检测出而未在生草乌组检测出成分9种。在之后深入研究中此类差异性成分可被重点关注为诃子汤炮制草乌机理研究对象。

此外，对已鉴定出成分具体从代谢位点及各代谢位点代谢量进行对比研究发现，与炮制草乌相比生草乌在肠壁吸收中入血成分种类较多且含量高，肠道菌及肝代谢入血成分较少且含量低，随着时间呈递减的趋势。而炮制草乌和诃子与生草乌相比，在肠道菌入血成分的种类多含量高，而在肠壁吸收中较少。由此本研究推断：经过诃子汤炮制草乌使草乌成分吸收代谢位点发生了变化，使草乌成分的吸收变缓慢且加速代谢，从而一方面缓解了毒性成分吸收过快而使血药浓度快速升高导致中毒，另一方面又加速代谢毒性成分降低血药浓度避免中毒，起到减毒效应。

表10 生草乌代谢成分可能代谢位点表

表11 诃子代谢成分可能代谢位点表

由于体内代谢成分在血液中比较少，且将代谢物作为质控成分及炮制机理研究成分，检测难度较大。因此本研究中暂未考虑代谢成分的作用。在后期研究时，可以融合指纹图谱/特征图谱等技术手段，将其与序贯代谢研究思路相结合，从而将部分代谢成分也纳入质控成分及炮制机理研究中，使本研究成果能更全面的应用于研究草乌炮制机理中，建立更加科学可行的中药炮制机理研究体系。