不同地区草乌种子中生物碱含量的测定与分析

山 丹 屈璐璐 李晓杰 马一鸣 王俊杰

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，呼和浩特 010011)

草乌(蒙药名泵阿)为毛茛科(Ranunculaceae)乌头属(Aconitum)多年生草本植物，又叫北乌头(AconitumkusnezoffiiReichb.)[1]，是现阶段开发利用的蒙药材之一。蒙药以干燥块根及干燥叶入药[2]，夏季叶茂盛花未开时采收，除去杂质，及时干燥[3]。具有祛风除湿、温经止痛之功效，味辛、苦、热，有大毒[4]。草乌入药的有效化学成分为乌头碱(aconitine)、次乌头碱(hypaeonitine)、新乌头碱(mesaeonitine)、苯甲酰乌头原碱(benzoylaconine)、苯甲酰新乌头原碱(benzoylmesaconine)、苯甲酰次乌头原碱(benzoylhypaconitine)等[5～7]，药理研究证明草乌具有镇痛、消炎、局部麻醉、抗肿瘤等作用[8]。草乌分布较广，因产地、植被等环境因素，各地草乌药用块根及叶子的生物碱类含量差别较大[9]，所以用药前测定或了解其生物碱含量对保障药材使用安全具有重要意义。目前，草乌种子的应用仅在植物繁殖方面[10～12]，用于药用方面的研究甚少，对于草乌种子是否含有生物碱成分，是否具有开发利用价值，未见研究报道。本研究采用HPLC法[13～16]对不同产地草乌种子的生物碱含量进行了测定与分析，为草乌种子的综合利用提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪(1525色谱泵，2428双波长紫外检测器，Breeze工作站)；超声波清洗器(SB25-12DTDN型宁波新芝生物科技股份有限公司)；循环多用真空泵(SHB-3型，郑州长城科工贸有限公司)；旋转蒸发仪(RE-52型，上海振捷实验设备有限公司)。

1.2 试药

乌头碱对照品(批号:302-27-2)、新乌头碱对照品(批号:2752-64-9)、次乌头碱对照品(批号:6900-87-4)、苯甲酰新乌头原碱对照品(批号:63238-67-5)、苯甲酰次乌头原碱对照品(批号:63238-66-4)(北京恒元启天化工技术研究院提供)。甲醇、三乙胺为色谱纯，水为超纯水，乙酸乙酯、异丙醇等试剂，其他为分析纯。

草乌种子采集于内蒙古地区(草乌的产地及采集时间见表1)。由内蒙古农业大学草原与资源环境学院王俊杰教授鉴定为蒙药草乌。

表1 研究材料

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Supersil ODS2 5 μm(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1 mol·L-1，三乙胺(75∶25)；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：235 nm；柱温：35℃。色谱图详见图1～4。

图1 1.苯甲酰新乌头原碱；2.苯甲酰次乌头原碱；3.新乌头碱；4.乌头碱；5.次乌头碱对照品HPLCFig.1 1.Standards for HPLC reference of benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

图2 草乌种子供试品HPLC图(产地内蒙古通辽市扎鲁特旗) 1.苯甲酰新乌头原碱；2.苯甲酰次乌头原碱；3.新乌头碱；4.乌头碱；5.次乌头碱Fig.2 HPLC chromatogram of alkaloids in A.kusnezoffii seeds(Zhalute of Tongliao City,Inner Mongolia) 1.Benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

图3 草乌种子供试品HPLC图(产地内蒙古赤峰市阿鲁科尔沁旗) 1.苯甲酰新乌头原碱；2.苯甲酰次乌头原碱；3.新乌头碱；4.乌头碱；5.次乌头碱Fig.3 HPLC chromatogram of alkaloids in A.kusnezoffii seeds(Alu Kerqin of Chifeng City,Inner Mongolia) 1.Benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

图4 草乌种子供试品HPLC图(产地内蒙古赤峰市巴林右旗) 1.苯甲酰新乌头原碱；2.苯甲酰次乌头原碱；3.新乌头碱；4.乌头碱；5.次乌头碱Fig.4 HPLC chromatogram of alkaloids in A.kusnezoffii seeds(Balin of Chifeng City,Inner Mongolia)1.Benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

2.2 对照品溶液制备

准确称取苯甲酰新乌头原碱1.02 mg、苯甲酰次乌头原碱1.15 mg、新乌头碱0.98 mg、乌头碱1.85 mg和次乌头碱1.06 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.3 供试品溶液制备

精密称取草乌种子样品粉末(过40目筛)各1.0 g，置具塞锥形瓶中，用氨试液湿润20 min，精密加乙酸乙酯和异丙醇混合溶液(1v∶1v∶1v)50 mL，密塞，摇匀，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，用乙酸乙酯和异丙醇混合溶液补足减失的重量，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，精密量取续滤液25 mL，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入10%盐酸水3 mL，溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

表2 2种单酯型生物碱线型范围考察结果

Table 2 The linear range investigation results for two types of monoester alkaloids

次数Number苯甲酰新乌头原碱Benzoyl neoaconitine苯甲酰次乌头原碱Benzoyl hypoaconitine进样量Injection amount(μg)峰面积Peak area进样量Injection amount(μg)峰面积Peak area10.204307520.233203420.408699980.464818830.6121051900.696406740.8161447210.928121451.0201847681.1510037961.2242196791.38115863

表3 3种双酯型生物碱线型范围考察结果

表4 加样回收率结果

2.4 线性关系考察

精密称取对照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，分别注入液相色谱仪，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：苯甲酰新乌头原碱Y=186 061x-6 996.3，r=0.999 6，线性范围0.204～1.224 μg；苯甲酰次乌头原碱Y=16 939x+14 338，r=0.999 1，线性范围0.230 0～1.380 0 μg；新乌头碱Y=950 912x-17 973，r=0.999 6，线性范围0.196 0～1.176 0 μg；乌头碱Y=4E+06x-16 827，r=0.999 1，线性范围0.037 0～0.222 0 μg；次乌头碱Y=5E+06x-21 405，r=0.999 1，线性范围0.021 2～0.127 2 μg由此可见，对照品进样量与峰面积呈良好的线性关系(表2～3)。

2.5 精密度试验

取供试样品溶液10 μL，按2.1色谱条件连续进样6次，测定5种生物碱的峰面积积分比值计算RSD，结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱RSD值均在1.4%～2.7%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取2.3项下供试品溶液，精密称取10 μL，按2.1项下的色谱条件进样检测，分别于0，2，4，6，10，14，16，24 h依次进样测定。结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱RSD值均在1.3%～3.1%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重现性试验

取同一批草乌种子药材，按2.3下方法制备成供试品溶液6份，精密吸取10 μL，并按2.1项下色谱条件进样测定，结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱RSD值均在0.88%～2.36%，表明特征图谱的测定方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品粉末0.5 g，共6份，分别精密称取相应量的乌头碱类标准品，按照2.3项下方法制备供试品溶液，并按照2.1项下色谱条件进行测定，计算回收率(见表4)。

2.9 样品测定

按照2.3项下方法制备供试品溶液3份，精密吸取10 μL，按2.1项下色谱条件对内蒙古通辽鲁北、赤峰天山和赛罕乌拉草乌种子有效成分进行含量测定(见表5)。

表5 3种不同产地草乌种子中乌头碱类成分含量

Table 5 Content of alkaloids inA.kusnezoffiiseeds from three different habitats(mg·g-1)

产地Origin赤峰市阿鲁科尔沁旗Alu Kerqin of Chifeng City赤峰市巴林右旗Balin of Chifeng City通辽市扎鲁特旗Zhalute of Tongliao City苯甲酰新乌头原碱Benzoyl neoaconitine8.22±0.06a7.64±0.06b7.85±0.06b苯甲酰次乌头原碱Benzoyl hypoaconitine0.68±0.01b0.49±0.01c1.41±0.08a总乌头原碱Total aconitine8.84±0.03a7.95±0.06b8.91±0.07a新乌头碱Neoaconitine0.38±0.01b0.58±0.02a0.28±0.01c乌头碱Aconitine0.72±0.01b1.09±0.06a0.66±0.01b次乌头碱Aconitine reference0.49±0.01a0.15±0.01c0.25±0.01b总双酯型生物碱Total diester alkaloids1.31±0.05b1.65±0.05a1.19±0.05b

3 讨论

(1)邵财[17]等研究认为，草乌药材(块根)中双酯型生物碱的量明显高于单酯型生物碱。本文研究结果显示，在草乌种子中单酯型生物碱的量高于双酯型生物碱，其中双酯型乌头碱含量为新乌头碱0.296 2～0.596 1 mg·g-1、乌头碱0.636 5～0.963 1 mg·g-1、次乌头碱0.153 4～0.486 3 mg·g-1，单酯型乌头碱含量为苯甲酰新乌头原碱7.512 6～8.256 3 mg·.g-1、苯甲酰次乌头原碱0.489 8～1.440 9 mg·g-1。这一结果表明，草乌种子与块根中单酯型生物碱和双酯型生物碱的含量变化规律相反。

(2)张艳[18]测定了不同产地的3批草乌块根中生物碱的含量，结果表明，草乌中主要含有乌头碱及苯甲酰乌头碱，其他生物碱的含量极低，但未对不同产地材料乌头碱含量变化规律进行比较分析。本研究结果显示，草乌种子与草乌药材中的含量不一致。种子中主要含有苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头碱和乌头碱，乌头碱含量居中，次乌头碱等含量最少。不同产地总乌头碱含量和单体乌头碱含量都存在差异。总乌头碱含量通辽市>赤峰市。单体乌头碱含量的变化规律是苯甲酰新乌头原碱含量依次为赤峰市阿鲁科尔沁旗>通辽市扎鲁特旗>赤峰市巴林右旗；苯甲酰次乌头原碱含量为通辽市样品的明显高于赤峰市2个产地的样品。次乌头碱含量为变化赤峰市阿鲁科尔沁旗>通辽市扎鲁特旗>赤峰市巴林右旗的样品。乌头碱及新乌头碱均为赤峰市2个产地的含量高于通辽市的样品含量。

(3)随志刚[19]等研究表明，在草乌药材中使用流动相为甲醇-0.1 mol·L-1∶三乙胺(65∶35)配比条件的酸碱性适中，适用性强，峰形稳定。本研究在草乌种子中使用此方法时，流动相跑机器时发生突然飘高，不稳定的现象，对色谱峰造成干扰。为了克服这种现象，本研究对流动相的比例进行调整，调整为甲醇-0.1 mol·L-1∶三乙胺(75∶25)，调整后克服了基线飘高现象，且5种被测组分分离度较好，峰展宽适中，效果显著[20]。表明测定草乌药材和种子时的流动相比例不同；测定草乌种子时流动相甲醇比例调高，三乙胺比例调低为最佳。