基于多元统计分析的不同诃子属药材多指标成分研究

李国卫，索彩仙，吴文平，潘礼业，胡绮萍，何嘉莹，孙冬梅

广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，佛山 528244

2020年版《中国药典》收载的诃子属药材品种有诃子、绒毛诃子、西青果。诃子性苦、酸、平，归肺、大肠经，为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.或绒毛诃子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的成熟果实，每年的秋、冬季果实成熟的时候采收；西青果别名藏青果，是使君子科植物诃子T.chebulaRetz.的干燥幼果[1]，每年的9～10月将尚未成熟的幼果采下，置于沸水中略煮烫，晒干或者是烘干。诃子、绒毛诃子及西青果化学成分较为相似，以可水解类鞣质为主[2-4]，还含有多酚类、黄酮类等化学成分。诃子具有抗病毒、抗炎、降血糖和镇咳等药理作用[5,6]，西青果清热生津，解毒，主治阴虚白喉，具有清除羟自由基、抗氧化等功效，临床常用于咽喉肿痛、咽炎等症状[7]，两者的药理作用、性味功效存在较大不同[8]。

目前针对诃子属的研究多以单个品种的含量测定及特征图谱为主，但未见有对诃子属药材的整体质量研究[9-14]。Zhao等[15]基于化学成分预测了诃子的Q-marker可能为没食子酸、诃子酸、诃藜勒酸、鞣花酸，在此基础上，本研究拟通过建立多指标含量测定方法，利用化学模式识别法，包括方差分析、聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，探讨诃子、绒毛诃子和西青果三者的差异，以期为诃子属药材的质量评价及资源利用提供参考依据。

1 仪器与材料

Waters H-Class型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；XP-26型百万分之一天平，ME204E型万分之一天平(瑞士Mettler公司)；Milli-Q超纯水净化系统(美国Millipore公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

没食子酸对照品(批号：110831-201906，含量：91.5%)、柯里拉京对照品(批号：111623-200301，含量：≥98%)，由中国食品药品检定研究院提供；诃子次酸对照品(批号：Yz0613211，含量：≥98%)由南京源植生物科技有限公司提供；安石榴苷(A&B)对照品(批号：CFS201901，含量：≥98%)、诃藜勒酸对照品(批号：CFS201901，含量：≥98%)、诃子酸对照品(批号：CFS201902，含量：≥98%)，由武汉天植生物技术有限公司提供；甲醇、乙腈为色谱纯；水为纯化水；其余试剂为分析纯。

实验所用药材共44批，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定，H1～H17号样品为使君子科植物诃子T.chebulaRetz.的干燥成熟果实；X1～X14号样品为使君子科植物诃子T.chebulaRetz.的干燥幼果；RH1～RH13为使君子科植物绒毛诃子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果实，详细信息见表1。

表1 药材信息来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸(B)为流动相，梯度洗脱(0～3 min，0%A；3～5 min，0%→3%A；5～12 min，3%→10%A；12～20 min，10%A；20～25 min，10%→14%A；25～35 min，14%→17%A；35～40 min，17%→21%A；40～45 min，21%→60%A；45～50 min，60%A)，流速为0.35 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为270 nm。

2.2 对照品溶液制备

取诃子次酸、没食子酸、安石榴苷(A&B)、柯里拉京、诃藜勒酸、诃子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为413.560、105.271、519.400、116.700、1609.552、495.635 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取本品粉末(过三号筛)约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，用70%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性

取“2.2”项下的对照品储备液，供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，诃子次酸、没食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、诃藜勒酸、诃子酸与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子在1.00～1.05之间。混合对照品溶液及供试品溶液见图1。

图1 对照品、供试品UPLC图Fig.1 UPLC chart of reference substance and sample注：A：混合对照品；B：诃子；C：西青果；D：绒毛诃子。1：诃子次酸；2：没食子酸；3：安石榴苷A；4：安石榴苷B；5：柯里拉京；6：诃藜勒酸；7：诃子酸。Note:A:Mixed references;B:Mature fruit of T.chebula Retz.;C:Immature fruit of T.chebula Retz.;D:Mature fruit of T.chebula Retz.var.tomentella Kurt.1:Chebulic acid;2:Gallic acid:3:Punicalagin A;4:Punicalagin B;5:Corilagin;6:Chebulagic acid;7:Chebulinic acid.

2.4.2 线性范围

取“2.2”项下的对照品储备液，加甲醇稀释制得6个不同质量浓度的对照品溶液，其中诃子次酸质量浓度分别为0.345、3.446、34.463、206.780、413.560、620.340 μg/mL，没食子酸质量浓度分别为0.351、3.509、35.090、105.271、210.542、315.812 μg/mL，安石榴苷A+B质量浓度分别为2.841、28.410、259.700、519.400、831.040、1 038.800 μg/mL，诃藜勒酸质量浓度分别为0.340、3.404、34.039、1 005.970、1 609.552、2 011.940 μg/mL，柯里拉京质量浓度分别为0.389、3.890、38.900、116.700、233.400、350.100 μg/mL，诃子酸质量浓度分别为0.346、3.459、34.594、495.635、793.016、991.270 μg/mL,以峰面积为纵坐标(y)，质量浓度(μg/mL)为横坐标(x)进行线性回归，得到各个对照品的线性关系良好，R2值均值0.999 5以上，结果见表2。

2.4.3 精密度试验

取同一供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，诃子酸、没食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、诃藜勒酸、诃子酸的峰面积RSD<2%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，按“2.1”项下的的色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，诃子酸、没食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、诃藜勒酸、诃子酸的峰面积RSD<2%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验

取样品粉末约0.25 g，平行6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，诃子酸、没食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、诃藜勒酸、诃子酸的峰面积RSD<2%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率考察

精密称取已知含量的诃子药材(H17)0.125 g，平行6份，加入与样品中含量等量的对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率。测得7个成分平均加样回收率均在97.34%～99.75%，RSD<3%，结果见表3。

表2 回归方程及线性范围

表3 加样回收考察

续表3(Continued Tab.3)

2.4.7 结果与分析

2.4.7.1 含量测定结果

精密称取44批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，得到含量测定结果，见表4。结果显示，3种药材的7个成分含量存在显著差异，RSD在33.03%～77.32%之间。其中，RSD≥50%的包括6个成分，分别为没食子酸(49.5%)、安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、诃藜勒酸、诃子酸；诃子次酸在不同批次样品中较为稳定，RSD为33.03%。

表4 含量测定结果

续表4 (Continued Tab.4)

2.4.7.2 方差分析

以上述7个含量测定指标为检验变量，诃子、西青果、绒毛诃子作为分组变量，采用SPSS 20.0软件，通过Shapiro-Wilk检验法对44批药材样品7个成分数据进行正态分布验证，结果显示7个指标的sig.值均小于0.05，不服从正态分布；因此采用非参数检验法(秩和检验)进行下一步分析，选择Kruskal-Wallis法进行对三个不同基原的7个指标进行两两比较，结果见表5。其中，安石榴苷A & B、诃藜勒酸在三组样品间均有极显著差异(P<0.01)；诃子次酸在诃子与西青果、西青果与绒毛诃子间有极显著差异(P<0.01)，在诃子与绒毛诃子间无显著差异；柯里拉京在诃子与绒毛诃子、西青果与绒毛诃子间有极显著统计学差异(P<0.01)，在诃子与西青果无显著差异；没食子酸在诃子与绒毛诃子、诃子与西青果间有极显著差异(P<0.01)；在绒毛诃子与西青果间无显著差异；诃子酸在西青果与绒毛诃子、诃子与绒毛诃子间有极显著差异(P<0.01)，在诃子与西青果间无显著差异；上述分析结果说明诃子、西青果、绒毛诃子三者间的成分含量存在差异。

表5 各含量指标分析表

2.4.7.3 聚类分类

运用SPSS软件对44批药材样品7个成分的含量测定结果进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以余弦距离作为样品相似度的距离公式，样品聚为3类(见图2)。13批绒毛诃子样品(RH1～RH13)聚为一类，14批诃子样品(H1～H14)聚为一类，14批西青果样品(X1～X14)与3批诃子(H15～H17)样品聚为一类。从总体数据来看，不同品种药材样品间具有明显差异，其中绒毛诃子与其他两种药材的差异较大，距离为25时就可以归为不同的类型；西青果和诃子具有一定的相似性，当距离为20时，可以聚为一类，当距离为15时，两者可以区分，但仍然有部分诃子样品未能在西青果样品中分离，在距离为5时才能完全分离，说明两者具有较高的相似性。

2.4.7.4 主成分分析

以7个成分含量测定结果为变量，采用SPSS 22.0软件进行主成分分析，由表6可知，共提取了2个特征值大于1的主成分，累积方差贡献率达86.674%，表明可以用2个主成分反映不同样品主要的质量特征。从表7可以看出，在第一主成分有较高载荷的包括安石榴苷A&B、柯里拉京、诃藜勒酸；在第二主成分有较高载荷的包括没食子酸、诃子酸。(载荷值>0.80)以降维得到的2个主成分得分作为X、Y轴，得到44个样品的散点分布图，结果显示，3种药材样品能实现较好区分，同类样品基本能聚在同一区域，说明3种药材之间的成分存在一定差异，结果见图4。三批诃子样品(H15～H17)与西青果样品聚在同一区域，与聚类分析结果一致。3种样品的主成分得分分析：西青果样品除X1的主成分2评分为-0.08外，2个主成分评分基本为正值；绒毛诃子样品主成分1评分均为负值，主成分2评分除个别批次(RH1)外均为正值；诃子样品除H15～H17外，其他样品的两个主成分评分基本为负值，结果见表8。

图2 44批药材样品聚类分析结果Fig.2 Cluster analysis results of 44 batches of samples

2.4.7.5 OPLS-DA

依据PCA结果，对3种不同药材样品进行OPLS-DA分析。该OPLS-DA模型，R2X(cum)=0.976，R2X(cum)=0.936，Q2(cum)=0.923，均大于0.5，说明模型稳定可靠，可用于使君子科不同药材样品的区分。结果显示，数据的分类算法中OPLS-DA的效果较好，可使3种样本点完全被分开，相互之间没有样品出现交叉的情况，且全部样品均位于95%可信区间之内，说明3种样品在这7种化学成分含量上存在一定的差异，结果见图5。采用变量重要性投影值(ariable importance in project，VIP)筛选体现3种样品差异性的标志物，其中VIP值大于1的成分包括3个，分别为诃子酸(VIP=1.06)、安石榴苷A&B(VIP=1.01)，是体现3种样品间差异的主要标志性成分，其余峰VIP值小于1，对样品的区分影响较小，结果见图5。

表6 特征根、各主成分的贡献率

表8 主成分得分

图3 主成分得分分布图Fig.3 Score plot of principal components

3 分析与讨论

3.1 检测条件的确定

安石榴苷A与安石榴苷B为一对同分异构体，且容易发生相互转化，本研究已在色谱条件下将两者分离，呈双峰，但考虑到两者容易发生相互转化若单独计算会影响加样回收率的计算，故以2个色谱峰峰面积之和计算。在200～400 nm处进行全波长扫描，诃子次酸、没食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、诃藜勒酸、诃子酸在270 nm均有最大吸收，故选择270 nm为同时测定波长。

图4 OPLS-DA得分图Fig.4 Score plot of OPLS-DA注：横坐标t[1]为预测主成分值；纵坐标t[2]为正交主成分值。Note:X-axis is predicted principal component value;Y-axis is orthogonal principal component value.

图5 7个化学成分的VIP值Fig.5 VIP value of 7 chemical components

3.2 多指标含量测定结果分析

本研究测定了2020年版《中国药典》收载的3种诃子属药材诃子、绒毛诃子、西青果中7种化学成分的含量，并结合方差分析、聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘法 - 判别分析等化学计量法分析了不同种药材含量的差异。方差分析结果显示，诃子次酸、安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、诃藜勒酸5个成分在西青果中含量均值均最高，且与其他两种药材的含量均值均有明显差异，P<0.05具有统计学意义；诃子酸在诃子中含量均值最高，且与其他两种药材的含量均值均有明显差异(P<0.01)具有统计学意义；没食子酸在绒毛诃子中含量最高，但与西青果的含量差异不大，但两者与诃子的含量均值有明显差异((P<0.01)具有统计学意义。聚类分析、主成分分析与正交偏最小二乘法-判别分析均可以将不同样品按品种进行划分，主成分分析结果显示安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、诃藜勒酸、没食子酸、诃子酸为体现不同品种差异的主要因素，正交偏最小二乘法-判别分析结果显示诃子酸、安石榴苷A&安石榴苷B为区分不同品种的主要因素。综上可见，不同诃子属药材的化学成分组成较为接近，其差异主要体现在不同化学成分的含量上，安石榴苷A、安石榴苷B、诃子酸、柯里拉京、诃藜勒酸、没食子酸等成分在不同诃子属药材间的差异较大，建议建立对诃子属药材的进行多指标质量控制，才能全面评价该类药材的质量。

在主成分分析结果中有三批诃子样品(H15～H17)其得分分布与西青果靠近，分析含量测定数据发现，这三批样品的含量数据均接近诃子、西青果整体含量均值的中间值，而诃子为使君子科植物诃子干燥成熟果实，而西青果则为使君子科植物诃子的干燥幼果，推测可能是由于果实成熟度不足导致。从本研究中的结果可以看出，除诃子酸外，诃子的其余6个指标均远低于西青果，诃子酸则大幅度高于西青果，说明诃子在成熟的过程中，其含量组成会发生转化，也从另一方面为诃子与西青果药效特点不一致提供了依据。

本研究建立了诃子属药材7个指标成分的UPLC含量测定方法，对44个不同药材样本进行了测定，并采用方差分析、聚类分析、主成分分析与正交偏最小二乘法-判别分析对含量测定结果进行了分析，分析结果显示3种诃子属药材的成分组成存在明显差异，为诃子属药材的质量控制提供了可靠的分析方法与参考依据。