正交试验优化改进清喉咽合剂提取工艺的研究

陆永梅 罗朝亮 邓日建

广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023

清喉咽合剂由地黄、麦冬、玄参、连翘、黄芩等五味药材组成，具有养阴清肺、利咽解毒的功效。用于阴虚燥热、火毒内蕴所致的咽部肿痛、咽干少津、咽部白腐有苔膜、喉核肿大；局限性的咽白喉、轻度中毒型白喉、急性扁桃体炎、咽峡炎等[1]。该产品适用于阴虚肺燥引起的咽喉部的各种不适症状，治疗效果很好，在市场中倍受欢迎。

经查阅有关清喉咽合剂的文献，有对其进行改剂型研究的，如清喉咽含片、清喉咽颗粒等[2-6]，但大部分都是对其质量标准的研究[7-10]，经笔者查阅文献未发现有关清喉咽合剂提取工艺进行改进的研究，在《中华人民共和国药典》一部的质量标准中的提取工艺采用渗漉和水提法，但该方法的缺点是提取时间很长，长时间占用了生产的设备，所以为缩短生产的时间和减少生产设备的使用时间，提高生产效率，进而节约成本，将采用回流提取法对清喉咽合剂进行提取，本试验通过正交试验对乙醇量、回流时间、乙醇浓度、回流次数等四个因素进行提取工艺优化研究，并与原工艺进行对比，同时以该处方中黄芩药材的主要成分黄芩苷为考核指标，结果新工艺优于原工艺，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 VARIAN210高效液相色谱仪(美国瓦里安公司)、检测器：UV检测器、电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司) 、超声波清洗器( 上海科导超声仪器有限公司，型号：SK5200H,功率200W) 、循环水真空泵( 巩义市予华仪器有限公司) 、旋转蒸发仪、干燥箱(上海跃进医疗器械厂)、超纯水机(Millipore S.A.S.)。

1.2 原料和对照品 药材饮片原料：地黄(批号：20211201，产地：河南)；麦冬(批号：20210901，产地：四川)；玄参(批号：20210401，产地：浙江)；连翘(批号：20211201，产地：山西)；黄芩(批号：20210801，产地：河北)。以上药材饮片均购于广西德润堂中药科技有限公司，经广西药用植物园副主任药师邓日建鉴定符合《中华人民共和国药典》2020版一部的相关规定。对照品和试剂：黄芩苷标准品(中国食品药品检定研究院，批号：110715-201821)，甲醇为色谱纯，检测用水为超纯水，磷酸为色谱纯。

2 实验方法

2.1 检测方法

2.1.1 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇超声处理使溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理(功率 200 W，频率59kHz)20 min，取出；放冷，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取 10 mL，置 25 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.2%磷酸溶液(28∶72)为流动相;检测波长为 278 nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。

2.1.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2 清喉咽合剂提取工艺单因素试验方法考察

2.2.1 清喉咽合剂回流提取工艺流程 取地黄、麦冬、玄参、连翘和黄芩五味药材，粉碎成粗粉，加入乙醇，回流提取两次，合并两次提取液，减压回收乙醇，定容到规定的体积。

2.2.2 加醇量对黄芩苷含量的影响 称取地黄18 g、麦冬16 g、玄参26 g、连翘31.5 g、黄芩31.5 g各五份，分别混合粉碎成粗粉，各加60%的乙醇为10 BV、12 BV、14 BV、16 BV、20 BV，分别按以上的回流提取流程进行操作，回流时间为2 h，回流两次，合并两次滤液，减压回收乙醇，浓缩到适量，用热水定容到100 mL，称重，备用。

2.2.3 回流时间对黄芩苷含量的影响 称取地黄18 g、麦冬16 g、玄参26 g、连翘31.5 g、黄芩31.5 g各五份，分别混合粉碎成粗粉，各加60%的乙醇为12 BV，分别按以上的回流提取流程进行操作，回流时间分别为0.5 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，回流两次，合并两次滤液，减压回收乙醇，浓缩到适量，用热水定容到100 mL，称重，备用。

2.2.4 乙醇浓度对黄芩苷含量的影响 称取地黄18 g、麦冬16 g、玄参26 g、连翘31.5 g、黄芩31.5 g各五份，分别混合粉碎成粗粉，各加40%、50%、60%、70%、80%的乙醇为12 BV，分别按以上的回流提取流程进行操作，回流时间分别为2 h，回流两次，合并两次滤液，减压回收乙醇，浓缩到适量，用热水定容到100 mL，称重，备用。

2.2.5 回流次数对黄芩苷含量的影响 称取地黄18 g、麦冬16 g、玄参26 g、连翘31.5 g、黄芩31.5 g各五份，分别混合粉碎成粗粉，各加60%的乙醇为12BV，分别按以上的回流提取流程进行操作，回流时间为2 h，分别按1次、2次、3次、4次、5次减压回收乙醇，浓缩到适量，用热水定容到100 mL，称重，备用。

2.3 清喉咽合剂提取工艺正交试验 以黄芩苷为考察指标，按以上的清喉咽合剂的回流提取方法进行提取试验，分别对加醇量(A)、回流时间(B)、乙醇浓度(C)、回流次数(D)这4个因素进行分别考察，根据单因素实验结果，每因素选取3个水平，按L9(34)进行正交试验。因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

3 试验结果

3.1 单因素试验结果

3.1.1 加醇量对黄芩苷含量的影响试验结果 按以上的加醇量样品进行取样，按相应的测定方法测定不同的加醇量对清喉咽合剂黄芩苷含量。如图1所示。

由图1可知，随着乙醇量的增加，黄芩苷含量增高，当加的乙醇量达到12 BV时，提高缓慢，依据考察指标，加乙醇量12 BV为最佳选择，含量能达到理想要求，从而降低生产成本。

3.1.2 回流时间对黄芩苷含量的影响试验结果 取以上相应的备用样品，按以上测定方法测定不同的回流时间对黄芩苷含量的影响。如图2所示。

由图2可知，随着回流时间的增大，黄芩苷的含量随着增加，当回流时间达到2 h后增幅变小，黄芩苷含量达到比较高的值，再增加回流时间含量增加不大，因此回流时间选择2 h为宜。

图1 加醇量对清喉咽合剂中黄芩苷含量的影响图 图2 回流时间对清喉咽合剂中黄芩苷含量的影响图

3.1.3 乙醇浓度对黄芩苷含量的影响试验结果 按该试验项下样品，照测定方法测定不同的乙醇浓度对清喉咽合剂中的黄芩苷含量影响。如图3所示。

从图3分析可知，随着所加入乙醇的浓度的增大，所提取得到的黄芩苷含量增加，当达到60%后基本达到高峰；再增加浓度对黄芩苷的含量的增幅不明显，所以应考虑60%为最佳提取浓度。

3.1.4 回流次数对黄芩苷含量的影响试验结果 按该试验项下样品，照测定方法测定不同的回流次数对清喉咽合剂中的黄芩苷含量影响。如图4所示。

从图4数据分析可知，随着回流次数的增大，所提取得到的黄芩苷含量增加，当达到2次后基本达到最高；再增加回流次数对黄芩苷的含量的增幅不明显，所以应考虑2次为最佳提取回流次数。

图3 乙醇浓度对清喉咽合剂中黄芩苷含量的影响图 图4 回流次数对清喉咽合剂中黄芩苷含量的影响图

3.2 正交试验结果与分析 按照以上的操作流程，通过检测结果，以黄芩苷含量为数值指标，通过极差R和均值K进行分析比较，优化清喉咽合剂的提取工艺的参数。结果见表2。

表2 正交试验表

从表2分析可知，以黄芩苷的含量为指标考核，其极差最大的是乙醇量(A)，可以看出提取工艺的主要影响因素是乙醇量(A)，其余因素影响次序为C>B>D，以黄芩苷的均值分析可知，最佳的提取工艺为A1B3C2D2，即最佳提取工艺为乙醇量为12BV，回流时间为2 h，乙醇浓度为60%，回流次数为2次，这样的提取黄芩苷的含量最佳。

3.3 清喉咽合剂HPLC色谱图 如图5所示。

A：黄芩苷对照品；B：供试品；C：黄芩苷阴性对照品图5 清喉咽合剂HPLC色谱图

4 验证试验

称取地黄18 g，麦冬16 g，玄参26 g，连翘31.5 g，黄芩31.5 g各三份，分别混合粉碎成粗粉，各加60%的乙醇为12 BV，分别按以上的回流提取流程进行操作，回流时间为2 h，回流两次，合并两次滤液，减压回收乙醇，浓缩到适量，用热水定容到100 mL，称重，备用。结果见表3。

表3 验证试验结果

从上表可知，RSD为1.0%，说明黄芩苷含量稳定，工艺科学、稳定、合理。

5 小结与讨论

本试验为对现有产品的标准工艺进行研究试验，是由于原有产品的标准工艺中的提取方法耗时和设备占用率高，因而生产效率低，成本高，本试验是在原标准的处方工艺不变的前提下所做的研究试验，因此通过本试验归结如下几点：①本试验所做的含量测定是测定了相应的物料的水份后折算的含量；②本试验最后得到的工艺乙醇浓度于原标准的浓度基本一致，说明新旧标准的吻合性；③ 对产品的处方没有改变，保证产品的一致性；④原标准工艺的生产周期为5～6d，用现本试验的提取工艺只需1d的时间，生产周期可以大大缩短；⑤研究的新工艺可以减少生产设备的占用时间，提高生产效率，节约生产成本；⑥经与原提取工艺对比了检测的高效液相色谱图与本研究的高效液相色谱图完全一致，说明所提取的成份没有改变，而得的含量于本试验所得含量相符；⑦本研究具有创新性。

因此，本研究试验可以为未来的产品标准的改进提供实验基础，从而提高产品的质量标准，为实际生产提供真实的参考依据。