曲札茋苷与盐酸法舒地尔联用对脑梗的保护作用研究

付传美 杨旭娟 刘一丹 孟 珂 黄 茜 陈建勋 刘军锋 杨兆祥* 刘国光

1. 昆明医科大学，云南 昆明 650500；2.昆药集团股份有限公司，云南 昆明 650100

脑卒中是全球第二大、中国第一大致死性疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率、高经济负担等五大特点， 严重影响了患者的身体健康和生活质量[1-2]，给社会和家庭带来了沉重负担。脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，缺血性脑卒中亦称“脑梗”，是脑血管闭塞或阻塞引起的脑供血不足而导致神经组织损伤，表现为能量代谢衰竭，细胞膜内外离子平衡紊乱，进而使兴奋性氨基酸释放，Ca2+超载，自由基、炎症因子大量释放，引发一系列级联反应。针对以上特点，目前临床上治疗脑梗的策略主要是恢复供血、改善循环以及神经保护[3]。考虑到其复杂的病理生理过程，针对任何单一环节的治疗都难以完全有效地阻止缺血损伤，联合用药有可能达到协同作用[4]。注射用曲札茋苷为昆药集团自主研制的拟用于急性脑梗患者的神经保护剂，可通过清除自由基、抗氧化、抗炎、抗凋亡作用等途径发挥神经保护作用[5-8]。盐酸法舒地尔是一种新型的异喹啉磺胺衍生物，主要通过抑制Rho激酶达到扩张血管、改善脑循环，也具有阻断炎症反应、抗氧化等作用[9-12]。 二者联用治疗缺血性脑卒中的研究鲜有报道，且有无联用的价值还需进一步探究。故本实验在动物水平上，通过观察全脑缺血后小鼠的存活时间，局灶性脑缺血再灌注24h时的神经行为学评分、脑梗死体积，血清中SOD活力、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6等含量变化，探讨二者联用对脑梗的保护作用及其能否产生协同增效作用，为临床的应用进行探索并提供理论依据。

1 材料

1.1 动物 雄性ICR小鼠，体重24～28 g，由昆药集团股份有限公司实验动物中心提供，生产许可证：SCXK(滇)K2019-0001，发证机关：昆明市科学技术局。小鼠采用透明塑料盒群养，每箱≤6只；温度20～25 ℃(日温差≤3 ℃)；湿度40%～70%；照明12 h∶12 h明暗交替，照度150～300 lx；噪音≤60 dB。实验动物使用许可证号：SYXK(滇)K2019-0001，发证机关：昆明市科学技术局。每日喂饲鼠用配合饲料，自由饮水，视情况更换笼具和垫料。

1.2 药品与主要试剂 注射用曲札茋苷(20 mg/支，含量98.7%，批号：20200530)，室温、避光、密闭保存。盐酸法舒地尔注射液(昆药集团股份有限公司，批号：20GE03-211，规格为2 mL∶30 mg，6支/盒)；依达拉奉右莰醇注射用浓溶液(先声药业，国药准字H20200007，批号：181-201017，规格为5 mL:依达拉奉10 mg与右莰醇2.5 mg，6支/盒)；丁苯酞氯化钠注射液(石药集团恩必普药业有限公司， 批号: 6182103107，规格为100 mL：丁苯酞25 mg与氯化钠0.9 g)，甘露醇注射液；(青岛明月海藻集团有限公司，批号:36150506)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma，CAS：298-96-4)，水合氯醛(山东西亚化学工业有限公司，批号:119957，Cas 号:302-17-0)。小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6试剂盒均购于武汉贝茵莱生物制剂有限公司；SOD、MDA试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器 AR224型电子分析天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；JX5001/5000g电子天平(上海浦春仪器计量有限公司)；PowerWave XS2型连续波长酶标仪(美国Bio Tek)；Biofuge Stratos型台式高速冷冻离心机(德国Thermo Scientific Heraeus公司)；各种规格移液器，德国Eppendorf公司；Millipore纯水处理系统(美国Millipore公司)；1622A3脑缺血再灌注模型线栓(线栓直径0.16±0.01，北京西浓科技有限公司)。

2 方法

2.1 双侧颈总动脉结扎小鼠全脑缺血模型 雄性小鼠84只，按体重随机分为7组：模型对照、丁苯酞(8.3 mg/kg)、曲札茋苷(3.35 mg/kg、6.7 mg/kg)、法舒地尔(7.5 mg/kg、15 mg/kg)、曲札茋苷联合盐酸法舒地尔(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)组，每组12只。各组动物每日按10 mL/kg体重尾静脉注射给药1次(联合给药间隔1 h)，连续5 d；末次给药15 min，用400 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉动物，仰位固定，颈部正中切口，分离、结扎双侧颈总动脉后缝合伤口。观察并记录每只小鼠自结扎至2 h内的死亡时间为耐缺血缺氧时间，对存活时间超过2 h者计为2 h。

2.2 线栓致局灶性脑缺血小鼠再灌注模型 参照文献[13-14]，取24～28 g雄性小鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，仰位固定、备皮、消毒后颈部正中切口，分离、结扎右侧颈总动脉脉(common carotid artery，CCA)近心端及颈外动脉(externalcarotid arter，ECA)；在CCA分叉处的近心端 2 ～ 3 mm 处切口， 插入线栓 8～10 mm， 使线栓进入颈内动脉( internal carotid artery，ICA)，穿过大脑中动脉( middle cerebralartery， MCA) 起始端至大脑前动脉近端， 阻断 MCA的所有血流来源，固定线栓，缝合切口回笼饲养；假手术组仅分离CCA、ECA。将造模动物分为6组：模型对照、阳性对照右莰醇(10 mg/kg )、曲札茋苷(3.35 mg/kg、6.7 mg/kg)、法舒地尔(7.5 mg/kg、15 mg/kg)及联合用药(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)组，每组12 只。造模后2 h，各组动物分别按10 mL/kg体重静脉注射给药(联合给药间隔1 h)，同时拔出线栓实现再灌。再灌后24 h，参照改良的 Longa 评分标准[15]对各组动物进行神经行为学评分后，眼球取血用于测定SOD、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6。处死小鼠，取脑切成厚度均为2 mm的脑片于1% TTC 溶液中，37 ℃、孵育20 min显色后， 4%多聚甲醛中固定 24 h 后，数码相机拍照， 以 Image J 软件统计全脑片与梗死区面积(红色区域为正常脑组织，苍白色区域为梗死区)，计算脑梗死体积百分率，脑梗死体积百分率=[(非缺血侧半球面积-缺血侧半球未梗死区面积)×厚度(2 mm)/全脑体积]×100%。

神经行为学评分(改良的 Longa 评分)。0分: 无明显神经功能缺损；1 分: 提尾时，对侧前肢不能前伸；2 分: 向缺血对侧转圈；3 分: 不能承受对侧自身重量；4 分: 无自主运动或意识障碍。分值越高，说明动物行为障碍越严重。

3 结果

3.1 对全脑缺血小鼠存活时间的影响 表1结果显示，与模型组比较，曲札茋苷低剂量(3.35 mg/kg)组、法舒地尔低剂量(7.5 mg/kg)组在2 h内死亡率与存活时间上均没有体现出差异；曲札茋苷高剂量(6.7 mg/kg)组、法舒地尔高剂量(15 mg/kg)组及低剂量联合用药(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)组均能明显延长全脑缺血小鼠的存活时间，降低2 h内的死亡率；其中，两药低剂量单用组与各自高剂量单用组比没有差异(P>0.05)，与低剂量联用组比，联用能明显延长存活时间、降低2 h内死亡率(P<0.01)；以上表明曲札茋苷联合法舒地尔对提高全脑缺血小鼠的耐缺血缺氧能力有协同作用。

表1 对全脑缺血小鼠存活时间的影响

3.2 对局灶性脑缺血再灌注小鼠脑梗死体积的影响 与假手术组比，模型小鼠表现出明显的行为学缺陷(P<0.01)和脑梗死(P<0.01)，表明造模成功(表2、图1) 。与模型组比，曲札茋苷低剂量(3.35 mg/kg)组、法舒地尔低剂量(7.5 mg/kg)组单用在神经行为学评及脑梗死体积上降低趋势不明显，均没有体现出差异；曲札茋苷高剂量(6.7 mg/kg)组、法舒地尔高剂量(15 mg/kg)组及低剂量联合用药(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)组对小鼠的神经行为学评分有降低的趋势，对脑梗死体积有明显的降低作用(P<0.05或P<0.01) ；其中，两药低剂量单用与各自高剂量单用比无差异(P>0.05)；与低剂量联用比，联用能明显降低脑梗死体积(P<0.01)。阳性对照右莰醇(10 mg/kg )亦可降低小鼠的行为学评分及脑梗死体积(P< 0.05，P<0.01) 。

3.3 对局灶性脑缺血再灌注小鼠血清中SOD、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6的影响 如表3 所示，与假手术组相比，模型组小鼠血清中 SOD 活性明显降低、MDA含量明显升高(P<0.01)，表明氧化应激失衡。与模型组比，曲札茋苷及联合用药组均能升高血清中SOD活性，均能减少MDA的生成(P<0.05)，且联合给药较两药单用组有不错的趋势。提示曲札茋苷联合法舒地尔提高了缺血再灌注模型小鼠的抗氧化能力。

表2 对缺血再灌注小鼠脑梗死体积的影响统计表

A:假手术；B：模型对照；C：阳性对照右坎醇(10 mg/kg )；D：曲札茋苷(6.7 mg/kg)；E：盐酸法舒地尔注射液(15 mg/kg)；F：曲札茋苷+盐酸法舒地尔注射液(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)

表3 对小鼠血清SOD、MDA含量的影响统计表

如表4所示，与假手术组相比，模型组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6明显增加(P<0.01)，表明炎症反应增强。与模型组比，曲札茋苷、盐酸法舒地尔注射液、联合用药组均能减少缺血再灌注小鼠血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 生成(P<0.05或P<0.01) ；且联合用药的效果较单用药组有更好的趋势。提示曲札茋苷联合法舒地尔提高了脑缺血小鼠的抗炎能力。

表4 对小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响统计表

4 讨论

脑梗又称缺血性脑卒中，是脑卒中最常见的类型，常产生一系列神经缺损症状，如神经系统缺血和缺氧性的坏死、脑水肿、炎症反应等，重者意识丧失，是病人致残和致死的主要原因[16]。脑缺血再灌注发生后脑组织中活性氧(reactive oxygen species，ROS)过量产生，炎症细胞聚集，产生大量炎症因子，谷氨酸兴奋性毒性，钙稳态失衡，细胞凋亡及血脑屏障(blood brain barrier，BBB)破坏等多种病理机制参与脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)[17-20]。氧化应激是缺血性脑损伤的主要病理机制，也是影响脑缺血严重程度的重要因素之一。CIRI激活炎症因子是导致脑损伤的重要机制。在正常人体内，自由基的生成、清除处于动态平衡，但在缺血性脑卒中发生后，过量自由基生成，进而出现细胞膜损伤、神经元死亡和脑组织梗死等。MDA是膜脂过氧化的重要产物，其可加剧细胞膜的损伤，与体内自由基的多少有关。SOD的水平高低间接反映机体清除氧自由基的能力，其本身有助于保护脑细胞免受氧自由基的损伤。缺血后细胞因子IL-1β、TNF-α 和IL-6刺激趋化因子中性粒细胞趋化因子、单核细胞趋化因子-1和巨噬细胞炎性蛋白-1产生和释放，促进单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞迁移[21]。TNF-α浓度在脑梗死症状出现后6～12 h在血清中升高，在梗死后24 h内脑脊液中显著升高，与梗死面积呈正相关[22]。IL-6刺激淋巴T细胞增殖渗透加重炎症反应，其抗炎作用主要体现在可以上调IL-1ra，实验证明IL-6缺陷鼠梗死后结局不好[23]。目前对脑卒中发病机制的研究得到不断地深入和发展，但其中各种机制相互关联的枢纽点尚不明确，有待更深入地研究；且面对复杂发病机制的缺血性脑卒中，单一的药物治疗并不足以应对脑缺血缺氧及再灌注引发的病理生理改变。

研究采用双侧颈总结扎的全脑缺血模型与局灶性脑缺血再灌注模型，主要从存活时间、神经功能评分、脑梗死体积、抗氧化应激指标(SOD、MDA)、抗炎(TNF-α、IL-6、IL-1β)等方面对比曲札茋苷、盐酸法舒地尔注射液单独给药及联合用药对脑梗的保护作用。全脑缺血模型选择丁苯酞作为阳性对照，考虑到其可改善脑缺血区的微循环和能量代谢，增加缺血部位脑血流量，能有效延长模型小鼠的存活时间；局灶性脑缺血再灌注模型选择依达拉奉右坎醇浓溶液作为阳性对照，其科学配伍了依达拉奉和右莰醇两种活性成分，应用两种成分清除自由基、抗炎等作用机制，可显著降低急性缺血性脑卒中引发的脑神经损伤。一项纳入1200名急性缺血性脑卒中患者的随机、双盲、头对头比较的III期研究[24]表明，对比单方依达拉奉注射液，依达拉奉右莰醇显示出明确的疗效优势、临床安全性相似，对国内卒中治疗来说意义重大。

法舒地尔作为一种脑血管及周围血管扩张药物，主要药理作用是扩张血管，抵抗血管痉挛，改善脑组织的微循环；减少炎症介质产生，减轻炎症反应[25-26]。曲札茋苷属二苯乙烯类化合物，结构中含有多个酚羟基，文献报道该类化合物具有多种药理活性，对心脑血管具有明显的保护作用，其机制包括抗氧化活性[27]、抗炎[28]、抗细胞凋亡[29]等。本实验结果显示，曲札茋苷低剂量(3.35 mg/kg)组、法舒地尔低剂量(7.5 mg/kg)组对双侧颈总结扎小鼠的存活时间，缺血再灌注小鼠的神经行为学评分、脑梗死体积无改善作用(P>0.05)。曲札茋苷高剂量(6.7 mg/kg)组、法舒地尔高剂量(15 mg/kg)组均能改善小鼠存活时间及脑梗体积(P<0.05或P<0.01)，也说明改善循环或是神经保护都发挥了脑保护作用。两药低剂量联用(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)能显著延长存活时间、降低脑梗死体积与神经行为学评分，降低TNF-α、IL-1β、IL-6与MDA含量，升高SOD活力(P<0.05或P<0.01)。与两药低剂量单用组比较，高剂量单用组对存活时间、脑梗死体积的保护作用没有显示出差异(P>0.05)，而低剂量联用组表现出差异(P<0.05或P<0.01)。表明通过改善循环或神经保护对脑梗的保护作用有限，联合用药可使曲札茋苷与法舒地尔在改善循环及神经保护方面发挥协同作用，从而进一步改善脑梗，这一结果也为临床应用提供理论依据。