全自动凯氏定氮仪法测定清开灵口服液的总氮量

董丽荣

昆明市食品药品检验所，云南 昆明 650100

清开灵口服液为临床常用的清热解毒类中成药，具有清热解毒、化痰通络、醒脑开窍之功效，主要成分为胆酸、珍珠母、猪去氧胆酸、栀子、水牛角、板蓝根、黄芩苷、金银花[1]。水牛角作为其中的主要原料，具有清热凉血、解毒、定惊之功效，主要药效学成分为氨基酸[2-3]，胆酸、猪去氧胆酸为含氮有机化合物。检验标准收载于2020版中国药典一部，原标准采用半微量凯氏定氮法测定总氮量[4]，半微量测定法存在操作及装置复杂、效率低、重现性差等不足。本实验采用全自动凯氏定氮仪法测定其总氮量，并对实验方法进行验证。

1 仪器与材料

1.1 仪器 全自动凯氏定氮仪 (型号：kjeltec8400)，瑞典FOSS公司生产， 具有凯氏蒸馏和自动滴定功能，最小滴定单位为0.004 mL，可根据滴定缸内溶液颜色变化进行终点判定，分析仪专用消化管体积为250 mL；消化仪(FOSS TecatorTM Digestor2520)，控温范围为50～440 ℃；梅特勒万分之一电子天平(型号：AL204)。

1.2 试药试剂及材料 五水合硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、氢氧化钠、95%乙醇、甲基红、溴甲酚绿、硫酸铵均为分析纯。吸收液：取0.1%甲基红乙醇溶液70 mL，0.1%溴甲酚绿乙醇溶液100 mL， 1%硼酸溶液10 L，混合、摇匀即得。清开林口服液为广州白云山明兴制药有限公司生产，批号：1201104。

2 方法

2.1 消解 精密吸取清开灵口服液5 mL，加入硫酸钾∶五水合硫酸铜(9∶1)5 g 混合均匀置于消化管中，加入10 mL浓硫酸，摇匀，静置半小时。消化时间和温度(200 ℃：30 min；420 ℃：90 min)，平行制备试剂空白2份。

2.2 仪器准备 先确认冷却水阀是否打开，再打开主机电源，并进行管路冲洗，确保吸收液、滴定液、稀释用水为新鲜配置。用所需滴定液润洗3次滴定器后再充满滴定器。放入空消化管加水，启动蒸汽发生器进，运行清洗程序3次。

2.3 仪器回收率实验 精密称取硫酸铵粉末0.1 g，平行取样 6份，加40%氢氧化钠溶液70 mL，稀释液(水)30 mL，接收液30 mL，蒸汽发生器功率为90%，测定其回收率。结果见表1。

硫酸铵理论含氮量(%)

平均回收率100.6%，RSD=0.2%。回收率在99%～101%范围内，RSD≤2%，测定结果的准确性、重复性符合要求。证明该自动凯氏定氮仪性能正常，方法参数设置合理，可进行样品测定。

2.4 蒸馏和滴定 取消化好的试剂空白和样品分别上机测定，加40%氢氧化钠溶液70 mL，稀释液(水)30 mL，吸收液30 mL，蒸汽发生器功率为90%，硫酸标准滴定浓度为0.05 mol/L。

2.6 参数优化 采用正交设计法优化消解及碱化时硫酸钾∶硫酸铜(9∶1)、浓硫酸、40%NaoH加入量，选用U6(63)表安排试验。选择总氮的含量作为指标，三种试剂加入量作为考察因素A、B、C，选择6个水平，每个水平各拟一次。均匀设计试验因素、水平及测定结果见表2。

实验结果显示，浓硫酸加入量为10 mL，硫酸钾∶硫酸铜(9∶1)加入量为5 g，40%NaoH加入量为70 mL时，测得样品含氮量最高。

3 方法验证实验

3.1 精密度实验 精密吸取清开林口服液5.0 mL，按照优化的凯氏定氮参数条件进行测试，平行测定6次，结果为：2.57 mg/mL、2.55 mg/mL、2.51 mg/mL、2.65 mg/mL、2.65 mg/mL、2.62 mg/mL，平均值为2.57 mg/mL，RSD为2.2%，表明本法精密度良好。

3.2 回收率实验 精密吸取3.0 mL清开林口服液6份，分别精密加入0.05 g、0.08 g、0.10 g硫酸铵各两份，按照优选的凯氏定氮测定条件，进行回收率试验。结果见表3。

表1 仪器回收率实验结果 (n=6)

表2 均匀设计实验因素和水平

表3 方法回收率实验结果 (n=6)

3.3 线性关系实验 精密吸取清开林口服液2.0 mL、5.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL，按照优选的凯氏定氮法测定，以取样量为(X)横坐标、总氮量为(Y)纵坐标绘制标准曲线，得线性方程Y=2.534X+0.207，r=0.9995。结果表明，清开林口服液取样量在2.0～12.0 mL 范围内与总氮量线性关系良好。

3.4 方法比对实验 精密吸取清开林口服液3.0 mL，参照药典方法规定条件，采用半微量凯氏定氮法对样品中氮含量进行测定，平行测定6份，结果为：2.65 mg/mL、2.50 mg/mL、2.70 mg/mL、2.80 mg/mL、2.45 mg/mL、2.40 mg/mL，平均值为2.58 mg/mL，RSD为6.1%。采用自动定氮仪法，得到的总氮量的平均值为2.6 mg/mL，RSD为2.2%(见3.1)。结果比较显示，全自动定氮仪法与传统半微量凯氏定氮法相比，两种方法的测定结果基本相同，无显著性差异，但是全自动凯氏定氮仪法组内相对标准偏差即变异系数要小，且精密度更好[6]。

3.5 稳定性实验 精密吸取清开林口服液5.0 mL，按优化的参数条件进行消解，分别在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h时测定总氮，不同时间点总氮含量的值为2.53 mg/mL、2.62 mg/mL、2.55 mg/mL、2.57 mg/mL、2.64 mg/mL，RSD 为1.8%，表明本法在24 h内稳定性良好。

4 结论

本文建立的自动凯氏定氮仪法测定清开灵口服液中总氮量的方法，从消化到蒸馏、滴定无试样转移过程，滴定终点可自动识别，减少了人为因素造成的误差[7]。具有重复性好、准确度高、快捷、高效的特点。可作为清开灵口服液中总氮量测定的有效方法。

5 讨论

凯氏定氮法的原理为：在催化剂(硫酸铜、硫酸钾)的作用下，样品中含氮有机物被浓硫酸氧化分解为二氧化碳、水和氨气，氨气与硫酸结合生成硫酸铵，再加入强碱溶液，中和消化处理后剩余的浓硫酸，并使(NH4)2SO4转化为NH4OH，通过加热蒸馏生成氨气逸出，被硼酸吸收液吸收，再用一定浓度的硫酸或盐酸标准溶液进行酸碱滴定，根据所用标准酸的量计算出待测物中的总氮量[8]。硫酸铵要在足够的碱液中才能使结合态的氨游离出来，所以用到的氢氧化钠需过量，过量的标志是加入40%的氢氧化钠后变为棕黑色溶液[9]。过量的氢氧化钠会与硫酸铜反应生成蓝色的氢氧化铜沉淀，氢氧化铜在蒸馏过程中受热分解成黑色的氧化铜沉淀。碱加入量不够会造成测定结果偏低[10]。

硫酸钾与浓硫酸作用生成硫酸氢钾可以提高反应体系的温度，从而提高溶液的沸点以加快反应中有机物的分解。硫酸钾的取用要适量,否则会使消化体系温度过高，使已生成的硫酸铵过热分解而造成氮的损失；硫酸铜除了可以起到催化作用，还可以作为指示剂指示消化终点的到达。使用催化剂的比例需适合,否则会导致消化过程时间过长,以及过量的催化剂与浓硫酸造成资源浪费及环境污染[11-12]。

接受液为1%的硼酸溶液，加入指示剂后正常颜色为酒红色，存储过程应避光热，若使用过程中发现颜色改变，应重新配置。

蒸汽发生器的功率为冬春设置为90%～100%，夏秋设置为80%～90%，功率设置过高测定过程中凯氏定氮仪系统整体过热，使测量值稍偏离真实值。滴定液消耗量在8～15 mL，含量结果在11.0～15.0 mg内准确性较高。