基于网络药理学探讨金铃子散改善痛经的作用机制*

李梦华，田丽颖，2△

1安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230038；2安徽中医药大学第二附属医院

原发性痛经（primary dysmenorrhea，PD）是一种无盆腔器质性病变的痛经，也被称为功能性痛经，其表现为月经前后或者每个月经期出现下腹肌肉痉挛性痛经，严重者还会伴有头痛、恶心、呕吐、腰腿肌肉酸痛。临床医学研究［1］表明，PD的发病机制主要与前列腺素、加压素、催产素、雌二醇和内皮素等有关，此外，内分泌功能失调也会导致子宫平滑肌/血管痉挛性收缩，或产生、释放致痛物质引发痛经。目前临床上西医学主要以口服非甾体抗炎药和避孕药治疗为主。中医药治疗PD方法多样，疗效可靠，且副作用少，外治以针刺治疗为主，内治以中药内服治疗为主，处方用药多以经方为主，主要方剂有四物汤、归脾汤、温经汤、金铃子散、四逆散、少腹逐瘀汤加减方等。

金铃子散出自《素问病机气宜保命集》，此书作者为“金元四大家”之一——刘完素。全方组方简练，仅由延胡索、川楝子成方，具有疏肝行气、活血散瘀、泻热止痛的功效。常用于肝气郁结化火、脾胃气滞不畅、肝胃不和引起的胸脘及胁腹部位疼痛，还可用于疝气、月经期腹部疼痛等。川楝子苦寒，有小毒，长于泄气分之实热，以行理气止痛之功效；延胡索味辛、苦，性温，长于行血气之滞。二药配伍，寒温结合，理气行血，具备止痛之功效。金铃子散的使用历史悠久，成方精简，疗效确切，在临床上应用广泛。

网络药理学是一门新兴的研究技术，它将传统药理学中优秀的思维模式与现代先进技术及内容相结合，如生物信息学、系统生物学、计算生物学及网络分析学等不同学科，通过构建“药物-靶点-疾病-靶点”的网络体系，展示药物复方的作用机制［2］。网络药理学以整体的角度探讨药物与疾病之间的关联及“多成分-多靶点”的作用关系，与祖国医学的辨证论治理念和整体观念殊途同归［3］。因此，基于上述理论研究，笔者采用中药网络药理学的方法分析传统中药复方金铃子散治疗PD的作用靶点，并分析其可能的作用机制，为金铃子散治疗PD的临床应用及研究提供可靠的理论依据。

1 资料与方法

1.1 金铃子散相关靶点筛选运用中医药系统药理学平台［4］（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）寻找金铃子散的2味中药化学组成成分，检索词为“延胡索”“川楝子”，设置ADME属性为口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18［5］，筛选出2味中药潜在的有效活性成分，删除未找到靶点的部分，检索出与金铃子散活性成分有关的潜在靶点。通过Uniprot数据库［6］（https：//www.uniprot.org/），将物种选定为“human”，查询各个靶点对应的基因名称，并获得规范的官方标准名称。

1.2 PD相关靶点筛选利用人类基因（Gene-Cards）［7］、在线人类孟德尔遗传（online mendelian inheritance in man，OMIM）［8］数据库、药物靶点（therapeutic target database，TTD）数 据库［9］，在数据库中分别输入关键词“primary dysmenorrhea”“dysmenorrhea”，检索与PD相关的基因靶点，合并获取的靶点后，去除重复值得到PD靶点，经Uniprot数据库校正基因名称。

1.3 构建金铃子散对PD靶点的预测以及“药物-疾病”蛋白互作网络在R语言中将金铃子散的药物相关靶点与PD疾病靶点进行对比分析，取得交集靶点并以韦恩图展示。进而将所获取的交集靶点导入STRING数据库（https：//cn.string-db.org/）获得PPI网 络 模 型［10］，选 定生 物种 类为“Homo sapiens”，设定为“highest confidence”（0.9），隐藏游离节点，默认其余设置，提交后得到PPI网络。导出包含作用节点关系信息的tsv文件，并输入Cytoscape 3.7.0软件［11］，构建“药物-疾病”蛋白互作网络。

1.4 GO富集和KEGG通路分析将金铃子散与PD的交集靶点导入David 6.8数据库［12-13］（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO富集分析，物种选择为“Homo sapiens”，设定P值小于0.01，通过David 6.8数据库的功能注释（functional Annotation）工具对GO富集分析下的细胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）进行分析。运用David 6.8进行KEGG通路富集分析，获得金铃子散治疗PD的相关生物学过程和各条关键的作用通路。

1.5 构建金铃子散“活性成分-靶点-通路”的可视化网络图运用Cytoscape 3.7.0软件对金铃子散活性成分及相关靶点进行可视化分析，构建金铃子散“活性成分-靶点-通路”的可视化网络图，进而分析得出金铃子散治疗PD的关键活性成分、靶点、通路。

2 结果

2.1 金铃子散有效活性成分初步筛选出延胡索化学成分77个，川楝子化学成分33个，经吸收、分布、代谢、排泄（absorption，distribution，metabolism，and excretion，ADME）筛选后，获得延胡索化学成分49个，川楝子化学成分6个；删除无对应靶点的部分，最终获得有效化学成分54个见表1。延胡索成分作用靶点1036个，川楝子成分作用靶点176个，合并后去除重复值，得到207个潜在作用靶点。

表1 金铃子散活性成分

2.2 PD相关靶点通过Genecards数据库获得痛经靶点301个，PD靶点299个。设定Score大于中位数的目标靶点为痛经的潜在靶点，如通过GeneCards所收集PD靶点Score最大值为40.49，因为所得最小值是0.9，所得中位数是8.77，所以将Score值设定为大于8.77，所得靶点即为PD的潜在疾病靶点。联系结合TTD、OMIM、DRUGBANK数据库补充完整痛经的疾病靶点，合并所有结果，删除重复值，得到683个相关靶点。

2.3 金铃子散活性成分-PD靶点PPI网络的构建将筛选的金铃子散活性成分靶点和痛经疾病靶点进行对比，获得交集靶点，绘制韦恩图见图1，得到金铃子散成分-痛经交集靶点59个。将交集靶点提交至STRING 11.0平台，得到金铃子散靶点PPI网络，下载tsv文件并导入Cytoscape 3.7.0软件中进行拓扑分析得到PPI网络图，图2。图中节点的degree值越大，则面积越大、越接近黄色，表示该节点在PPI网络图中作用越重要。金铃子散治疗PD的靶点中degree值排名前10的是TP53、VEGFA、AKT1、EGFR、IL6、TNF、FOS、MYC、CCND1、ESR1，表明它们可能是调治痛经的关键靶点。见表2。

图1 金铃子散药物成分-痛经靶点韦恩图

图2 金铃子散靶点PPI网络图

表2 金铃子散调治PD的主要靶点

2.4 GO富集分析将59个药物-疾病交集靶点导入数据库David 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO富集分析，设定物种为Homo sapiens，P值小于0.01，进行GO功能富集分析，其中涉及的生物学过程（biological process，BP）156个，主要包括蛋白质磷酸化的正调节、药物反应、细胞对有机环状化合物的反应、基因表达的正调控、正调控转录，DNA模板化、炎症反应、正向调节、对制动应激的反应、胞增殖的负调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等。涉及分子功能（molecular function，MF）40个，主要包括酶结合、转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、类固醇结合、相同的蛋白质结合、氧化还原酶活性、蛋白质异二聚活性、蛋白质结合、序列特异性DNA结合等。涉及细胞组成（cellular component，CC）15个，主要包括细胞外间隙、细胞外区域、细胞器膜、蛋白质复合体、轴突末端、膜筏、血小板α颗粒管腔、质膜、内质网膜、蛋白质细胞外基质等。根据P值大小，将显著性前10的条目进行可视化，见图3。

图3 GO富集分析

2.5 KEGG富集分析KEGG是包含了细胞和生物高级功能的注释的数据库，包括KEGG路径图，BRITE层次结构和KEGG模块［14］。对金铃子散59个潜在靶点KEGG通路进行富集分析共得到85条信号通路，根据P值小于0.01，筛选得到53条信号通路，主要涉及癌症通路、蛋白多糖与癌症、癌症中的MicroRNA、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、FoxO信号通路、p53信号通路、HIF-1信号通路等，提示金铃子散通过多通路、多靶点起到调治PD的作用。排名前20的信号通路见图4。

图4 KEGG信号通路富集分析

2.6 “活性成分-靶点-通路”网络图的构建将所得数据导入Cytoscape 3.7.0软件，构建金铃子散“活性成分-靶点-通路”可视化网络图（图3），其中黄色菱形表示的是延胡索的48个活性成分，绿色椭圆形表示的是川楝子的5个活性成分，蓝色三角形表示2味中药共有的1个相同活性成分，蓝色矩形表示靶点，红色倒三角形表示信号通路。通过Cytoscape软件的NetworkAnalyzer插件分析金铃子散治疗PD网络拓扑学参数，得到金铃子散治疗PD的核心成分及核心靶点，按degree值排列。经Cytoscape分析显示，槲皮素quercetin节点度值（Degree）为302，预测槲皮素为金铃子散治疗PD的最主要活性成分，随后依次为金黄紫堇碱（S）-Scoulerine（Degree值36）、四氢非洲方己碱Isocorypalmine（Degree值35）、罗通定Hyndarin（Degree值32）、狮足草碱leonticine（Degree值32），见图5。

图5 “活性成分-靶点-通路”网络

3 讨论

根据是否有盆腔脏器的器质性病理改变可将痛经分为两类，分别为PD和继发性痛经。PD无盆腔脏器的器质性病变，以青少年期多见，多发生于月经初潮后半年到1年内，影响女性的正常生活。国内研究显示，中国女性痛经发生率为33.1%，其中PD占53.2%，痛经严重影响工作者占13.53%［15］。研究中药对PD的调治方法具有重要临床价值和意义。我国传统医学中，痛经被称为“经行腹痛”，最早见于《金匮要略·妇人杂病脉证并治》：“带下，经水不利，少腹满痛，经一月再见。”［16］中医药调治PD的效果不亚于现代临床药物，在缓解疼痛和调理月经方面疗效明显。

本课题利用网络药理学的方法初步筛选，得出金铃子散调治PD的主要活性成分有槲皮素、金黄紫堇碱、四氢非洲方己碱、罗通定、狮足草碱等。槲皮素是金铃子散中两味中药的共有成分，也是此方剂中对应靶点最多的活性成分，是一种具有强抗炎能力的长效抗炎物质［17］。有学者［18］认为，槲皮素及其衍生物是炎症和疼痛管理的有用工具，并提出槲皮素的镇痛活性是源于其抗炎特性的观点。

金铃子散调治PD主要通过TP53、VEGFA、AKT1、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）发挥作用。PD的病理生理学主要与前列腺素（prostaglandin，PG）水平升高有关［19-20］。TP53编码的蛋白对多种细胞应激反应，调节表达靶基因，从而诱导细胞周期的改变［21］。T细胞分泌的炎性因子IL-6通过诱导炎症反应引起子宫平滑肌缺血缺氧，造成局部炎性反应，使宫腔内组织坏死导致痛经［22］。蛋白激酶B1与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可参与调节血管重塑及血管再生的重要过程，在月经期AKT1可能有利于修复子宫内膜，或许与AKT1可以促进新生血管内皮生长有关。

根据GO和KEGG通路富集分析显示，金铃子散治疗PD主要涉及癌症通路、PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、P53信号通路等。KEGG富集结果表明金铃子散能通过多通路对PD起到治疗作用。

综上所述，金铃子散是通过多靶点多通路起到调治PD作用的。它主要通过对关键靶点TP53、VEGFA、AKT1、EGFR以及IL6的表达进行调节来达到目的。此外，它还作用于细胞生物过程，最终作用于炎症相关通路（P53、TNF信号通路），从而抑制前列腺素的合成及相关的炎性反应，减少子宫异常收缩带来的缺血缺氧、缓解疼痛，达到对PD的治疗目的。但本研究限于网络数据库和数据软件分析层面上，后续需在动物实验上加以验证，以求完善。