加味丹玄口康通过Axin1 调节口腔上皮损伤细胞增殖活性

王宗康，谭怡丝，覃一杰，周领航，肖艳波，胡兆勇，谭 劲*

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

口腔黏膜下纤维化（oral submucosal fibrosis,OSF）是一种常见的口腔癌前病变。 7%～30%的OSF患者可能患上口腔鳞状细胞癌[1-2]。 OSF 常发生于颊黏膜、磨牙后区和软腭部位[2-3]。 其主要症状包括口干、疼痛、舌头活动受限、吞咽困难和活动性改变[3]。除了口腔，OSF 病变甚至涉及咽部和食管，严重影响患者的生活质量。调查研究表明，OSF 患者的患癌风险高于非OSF 患者[4]，且OSF 的患病率正逐年增加[5]。目前，OSF 的治疗主要包括药物治疗、张口锻炼和手术。对于在晚期结束手术的OSF 患者，术后仍需使用药物辅助治疗[6]。 口腔锻炼因其低成本、方便和无创等优点，是患者最容易接受的治疗手段[7]。 但其治疗效果有限，需要患者自我控制。因此，寻找高效、价廉且方便的治疗药物已迫在眉睫。

加味丹玄口康（DXKK）颗粒由丹参、玄参、当归、红花、生地黄、白花蛇舌草、夏枯草、生黄芪、薄荷、白芍、茵陈、桔梗组成。 前期研究表明，DXKK 对OSF 的发生与发展有抑制作用[8]。 轴抑制蛋白1（axis inhibition protein 1, Axin1），分子量约95.6 kDa，是Wnt 信号通路的重要支架蛋白，且可通过β-catenin信号调节细胞的增殖活性[9-10]。 Wnt 信号通路与口腔癌病变显著相关[11]。 在口腔癌临床样本中，Axin1 基因常发生突变[12]。 Axin1 可能作为口腔癌的突变靶点，参与口腔癌的发生和发展。然而，Axin1 在口腔癌前病变OSF 中的作用尚不明确。 本研究通过探究DXKK对口腔上皮损伤细胞增殖活性的影响及Axin1 的作用，旨在为DXKK 的临床治疗应用提供数据支持。

1 材料

1.1 细胞株

人口腔上皮细胞（批号：CP-H203）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。 在37 ℃、5% CO2和饱和湿度的环境条件下，细胞培养于人口腔上皮细胞完全培养基中。

1.2 实验动物

10 只健康的SD 雄性大鼠，体质量（200±20） g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2019-0004。在自由采食、（24±3） ℃、45%～50%湿度和SPF 条件下适应性饲养1 周后，进行药物干预处理。本研究经湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准通过，审批号：LLBH-202103100002。

1.3 主要药物与试剂

DXKK 三九颗粒制剂：丹参10 g（批号：2017003C），玄参10 g（批号：2108005C），当归10 g（批号：2106029C），红花5 g（批号：2103003C），生地黄10 g（批号：2108020S），白花蛇舌草10 g（批号：2101001S），夏枯草10 g（批号：2109004S），生黄芪10 g（批号：2102003C），薄荷10 g（批号：2102001C），白芍10 g（批号：2105009S），茵陈10 g（批号：2108001C），桔梗10 g（批号：2107001S），购自湖南中医药大学第一附属医院门诊三九智能颗粒中药房。

氢溴酸槟榔碱（arecoline hydrobromide, AH，批号：300-08-3，成都德思特生物技术有限公司）；人口腔上皮细胞完全培养基（批号：CM-H203，武汉普诺赛生命科技有限公司）；过表达对照质粒（批号：2021062301）、Axin1 过表达质粒（批号：2021062302）、干扰小RNA（small interfering RNA, siRNA）阴性对照（批号：2021062308）、Axin1 siRNA-（1-3）（批号：2021062309）、RIPA 裂解液（批 号：01E220303）、脱脂奶粉（批号：12C211125）均购自长沙艾碧维生物科技有限公司；Lip 2000（批号：11668019）、Trizol（批号：343912）均购自赛默飞世尔科技有限公司；互补DNA 合成试剂盒（批号：26621，北京康为世纪生物科技有限公司）；Axin1（批号：BA04288597，北京博奥森生物技术有限公司）；β-catenin（批号：00048568）、Bax（批 号：00039968）、Bcl-2（批 号：00011619）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA，批号：00086617）、β-actin（批号：10011066）、辣根过氧化酶羊抗鼠IgG（批号：20000002）、辣根过氧化酶羊抗兔IgG（批号：20000003）购自美国Proteintech 公司；Caspase-3（批号：45，美国CST公司）；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8，批号：NU679， 日本同仁化学研究所）；4%多聚甲醛（批号：N1012， 苏州新赛美生物科技有限公司）；结晶紫（批号：G1062，北京索莱宝科技有限公司）；碘化丙啶（批号：MB2920，大连美仑生物技术有限公司）；EdU 检测试剂盒（批号：U0618，广州瑞博生物医药科技有限公司）。

1.4 主要仪器

倒置生物显微镜（型号：DSZ2000X，北京中显恒业仪器仪表有限公司）；台式冷冻离心机（型号：H1650R，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）；荧光定量PCR 仪（批号：A51685，赛默飞世尔科技有限公司）；电泳仪（型号：DYY-6C，北京六一生物科技有限公司）；多功能酶标分析仪（型号：MB-530，深圳市汇松科技发展有限公司）；流式细胞仪（型号：A00-1-1102，美国贝克曼库尔特有限公司）。

2 方法

2.1 质粒转染与分组

为筛选高效抑制靶点，将口腔上皮细胞随机分组为：空白对照组、干扰对照组（转染siRNA 阴性对照）、Axin1 干扰-1 组（转染Axin1 siRNA-1）、Axin1干扰-2 组（转染Axin1 siRNA-2）、Axin1 干扰-3 组（转 染Axin1 siRNA-3）。 siRNA 阴 性 对 照、Axin1 siRNA-1、Axin1 siRNA-2 和Axin1 siRNA-3 通 过Lip 2000 转染至上皮细胞。 在37 ℃培养24 h 后，通过qRT-PCR 检测Axin1 的基因表达水平。

为鉴定Axin1 对细胞增殖活性的影响，将对数期生长的细胞随机分组为：空白对照组、干扰对照组、Axin1 干扰组、过表达对照组、Axin1 过表达组。siRNA 阴性对照、Axin1 siRNA、过表达对照质粒或Axin1 过表达质粒通过Lip 2000 转染至上皮细胞。24 h 后，进行其他实验分析。

2.2 qRT-PCR 检测Axin1 的基因和mRNA 的表达水平

采用Trizol 法提取细胞中的总RNA。采用20 μL反应体系，根据HiFiScript 互补DNA 合成试剂盒说明书合成互补DNA。 以互补DNA 为模板，采用实时荧光定量PCR 检测各组细胞中的Axin1 的基因表达水平。 其中，实时定量PCR 采用30 μL 体系，40个循环。2-ΔΔCt被用来计算RNA 表达量。Axin1 采用βactin 作为内参。 引物序列见表1。

表1 引物序列

2.3 Western blot 检测蛋白表达

采用RIPA 裂解液提取细胞中的总蛋白。 在恒压75 V 条件下进行SDS-PAGE 电泳分离蛋白。 在恒流300 mA 的条件下，蛋白被转移到硝酸纤维素膜上。采用5%脱脂牛奶封闭，4 ℃过夜。Axin1（1 ∶1000）、β-catenin（1 ∶5000）、PCNA（1 ∶3000）、Bax（1∶6000）、Bcl-2（1∶3000）、Caspase-3（1∶1000）和βactin（1∶5000）室温孵育90 min，磷酸缓冲液清洗。辣根过氧化酶羊抗鼠IgG（1∶5000）和辣根过氧化酶羊抗兔IgG（1∶6000）室温孵育60 min。 清洗后加电化学发光显色液显色。 Quantity One 软件分析各条带的吸光度值。

2.4 CCK-8 分析细胞活性

取在96 孔板中培养好的细胞，去除含药培养基每孔加入100 μL 含有CCK-8 的培养基。 其中，以10 μL/孔的量，提前用完全培养基配制含CCK-8 的培养基。继续孵育4 h 后，采用Bio-Tek 酶标仪分析450 nm 下的吸光度值。

2.5 平板克隆鉴定细胞增殖能力

将各组培养好的细胞用0.25%胰酶消化液消化并制成细胞悬液，调整细胞密度约为1×105个/mL。每组各取200 个/mL 细胞接种于6 孔板，37 ℃、5%CO2的培养箱中，每3 d 换液1 次，培养约3 周。 将培养好的细胞用4%多聚甲醛固定30 min。 0.5%结晶紫染色5 min 后，用清水洗3 遍。 相机拍照后，用酶标仪测定550 nm 下的吸光度值。

2.6 流式细胞术分析细胞周期

取出培养好的细胞，加入低温PBS 漂洗细胞并使细胞重悬。加入1.2 mL 预冷的乙醇后，4 ℃放置过夜。采用PBS 去除乙醇。在4 ℃避光环境下，150 μL碘化丙啶工作液染色30 min。 流式细胞仪测定各细胞周期的百分率。

2.7 含药血清制备与分组

2.7.1 含药血清制备 如前期研究所述[13]，制备含DXKK 血清。SD 雄性大鼠被随机分为空白对照组和DXKK 处理组，每组5 只。 DXKK 组的大鼠以组方12 g/kg（按大鼠与人的体表面积换算公式[14]计算，相当70 kg 成人剂量的3 倍）进行灌胃给药，持续1周。空白对照组的大鼠以生理盐水进行灌胃，持续1周。经腹腔麻醉后，在无菌条件下对大鼠进行腹主动脉采血。 血液室温静置2 h 后，进行离心、灭活和除菌。 分装后置于-20 ℃的冰箱中冻存。

2.7.2 细胞分组与处理 取对数期生长的细胞，随机分组为：空白对照组、AH 刺激组、空白血清干预组（AH 刺激+空白血清）、含DXKK 血清干预组（AH刺激+含DXKK 血清）、含DXKK 血清干预+Axin1过表达组。细胞通过AH（50 μg/mL）、空白血清或含DXKK 血清干预48 h 后，再进行其他实验检测。 其中，血清（空白血清或含DXKK 血清）与口腔上皮细胞完全培养基按体积1∶9 的比例被配制成含10%含药血清。含DXKK 血清干预+Axin1 过表达组的细胞在转染Axin1 过表达质粒后进行AH 和DXKK 干预。 空白对照组不做任何处理。

2.8 EdU 细胞增殖活性分析

取对数期生长的细胞，加入提前制备好的50 μmol EdU 培养基，37 ℃孵育过夜。 弃培养基，PBS 清洗2次。采用50 μL 4%多聚甲醛固定细胞。Apollo 染色液和Hoechst 33342 染色液分别在室温、避光条件下孵育30 min 染色后，PBS 清洗2 次。 采用显微镜观察和拍照。

2.9 统计学分析

采用SPSS 23.0 和GraphPad Prism 8.0.1 进行统计分析。 实验结果以“±s”表示。 采用One-way ANOVA 和Two-way ANOVA 分析多组间的数据。以P<0.05 代表差异有统计学意义。

3 结果

3.1 筛选Axin1 的干扰靶点

与干扰对照组比较，Axin1 干扰-1 组、Axin1 干扰-2 组和Axin1 干扰-3 组Axin1 的基因表达水平均显著降低（P<0.01）。其中，Axin1 干扰-2 组的抑制效果最明显。因此，选择Axin1 siRNA-2 进行后续实验。 干扰对照组Axin1 的基因表达水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 详见图1。

图1 Axin1 干扰靶点的筛选

3.2 调控Axin1 影响口腔上皮细胞增殖活性

与干扰对照组比较，Axin1 干扰组Axin1 mRNA的表达水平显著下降（P<0.01）。与过表达对照组比较，Axin1 过表达组Axin1 mRNA 的表达水平显著升高（P<0.01）。空白对照组、过表达对照组和干扰对照组间Axin1 mRNA 的表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。与干扰对照组比较，Axin1 干扰组细胞增殖活性显著升高（P<0.01）。 与过表达对照组比较，Axin1过表达组细胞增殖活性显著降低（P<0.01）。 详见图2。

图2 调控Axin1 影响口腔上皮细胞增殖活性

3.3 Axin1 影响增殖、凋亡相关蛋白的表达

与干扰对照组比较，Axin1 干扰组Axin1、Bax、cleaved Caspase-3 蛋白表达显著降低（P<0.05 或P<0.01），β-catenin、PCNA、Bcl-2 蛋白表达显著升高（P<0.01）。 与过表达对照组比较，Axin1 过表达组Axin1、Bax、cleaved Caspase-3 蛋 白 表 达 显 著 升 高（P<0.01），β-catenin、PCNA、Bcl-2 蛋白表达显著降低（P<0.01）。 详见图3、表2。

表2 各组上皮细胞中凋亡相关蛋白的表达比较

图3 Axin1 影响凋亡相关蛋白的表达

3.4 过表达Axin1 促进G1/S 期细胞周期阻滞

与过表达对照组比较，Axin1 过表达组处于G1期的细胞比例显著降低（P<0.01），处于S 期的细胞比例显著升高（P<0.01）。 详见图4。

图4 过表达Axin1 影响口腔上皮细胞的周期调控

3.5 DXKK 调控Axin1 影响口腔上皮细胞增殖活性

与空白对照组比较，AH 刺激组Axin1 蛋白表达显著升高（P<0.01），细胞增殖活性显著降低（P<0.01）。 与空白血清干预组比较，含DXKK 血清干预组Axin1 蛋白表达显著降低（P<0.01），细胞增殖活性显著升高（P<0.01）。 与含DXKK 血清干预组比较，含DXKK血清干预+Axin1 过表达组Axin1 蛋白表达显著升高（P<0.05）， 细胞增殖活性显著降低 （P<0.05）。 详见图5。

图5 DXKK 调控Axin1 影响口腔上皮细胞增殖活性

4 讨论

Axin1 的表达与细胞的增殖、凋亡密切相关[15-16]。本研究发现，在沉默/过表达Axin1 后，口腔上皮细胞的增殖活性随之发生改变。 蛋白水平上，增殖、凋亡相关指标（PCNA、Bax、Bcl-2 和Caspase-3）也同样受到影响，表明Axin1 参与口腔上皮细胞增殖、凋亡的生物学过程。 类似的，Axin1 作为肿瘤抑制因子参与肝细胞癌的增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化[17]。靶向Axin1 可以调控细胞的增殖、凋亡水平，影响帕金森病的发展[18]。 在缺氧诱导的心肌细胞损伤模型中，miR-3574 可通过抑制Axin1 影响细胞凋亡水平[19]。这些与本研究的结论一致，Axin1 可影响细胞的增殖活性。在过表达Axin1 后，细胞发生G1/S 期阻滞。这与前期研究发现一致，过表达Axin1 可诱导G1/S期细胞周期停滞[20]。 Axin1，Axin 蛋白中的一种，作为β-catenin破坏复合物的中心支架，与破坏复合物的其他核心成分相互作用[21-22]。 经典的Wnt 信号通路参与并控制许多生物过程，包括细胞生长、增殖和分化[23-24]。 同样，失调的Wnt 信号通路影响OSF 的发展[25]，促进口腔癌变[26]。 破坏复合物对细胞溶质βcatenin 的降解是Wnt 通路的关键调控步骤[21]。 其中，Axin1参与复合物的组装。 本研究证实，Axin1 沉默/过表达后，β-catenin 的蛋白水平发生改变。 这进一步表明，Axin1 可以通过β-catenin 信号影响细胞的增殖能力。

本课题组前期研究表明，DXKK 在治疗OSF 中具有明显的缓解效果[8]。 由丹参、玄参、当归、红花、生地黄、白花蛇舌草、夏枯草、生黄芪、薄荷、白芍、茵陈和桔梗等天然药物研制而成的DXKK，具有活血化瘀、扶正祛邪等功效[8]。 其中，丹参、当归和红花活血化瘀，生黄芪益气扶正，生地黄和玄参养阴清热，白花蛇舌草解毒散瘀，薄荷辛凉爽口、疏散风热[27]。临床研究表明，DXKK 可改善患者体内微循环、调整血液状态[27]。 本研究发现，OSF 可以调节Axin1 的表达。 在AH 诱导的口腔上皮细胞损伤模型中，Axin1的表达增加。而在DXKK 含药血清处理后，Axin1 的表达受到抑制，且伴随细胞增殖活性的上调，这表明DXKK 通过调控Axin1，缓解AH 诱导的细胞损伤。过表达Axin1 后，DXKK 对口腔上皮损伤细胞的增殖促进作用受到影响，提示Axin1 介导DXKK 缓解AH 诱导的上皮细胞损伤。

综上所述，Axin1 可能介导DXKK 缓解AH 诱导的口腔上皮细胞细胞损伤，这将为探究DXKK 治疗OSF 的内在机制提供可靠的科学线索。