参苓白术散调节AMPK、ABCG2 改善高尿酸血症模型小鼠尿酸的实验研究

汪永辉，萧 闵*，李 瑛，马 珑，江晓翠，王 岚，龚 健，王武胜

（1.湖北中医药大学黄家湖医院，湖北 武汉 430065；2.湖北中医药大学中医药实验中心，湖北 武汉 430065；3.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065）

高尿酸血症（hyperuricemia, HUA）是内源性嘌呤代谢紊乱引起机体尿酸盐结晶析出，沉积于身体各部位，损伤机体功能的代谢异常综合征。临床最常见的表现为尿酸盐结晶沉积于关节，诱发痛风；并且血清长期高尿酸（uric acid, UA）状态也是糖尿病、高血压、慢性肾病、脑卒中等多种疾病发生发展的重要诱因[1-2]。 UA 排泄异常是HUA 主要发病机制，故影响UA 转运的蛋白是治疗HUA 的靶向分子之一。ATP 结合盒转运体G2（ATP-binding cassette transporter G2, ABCG2）是一类跨生物膜运输的蛋白，可利用ATP 水解释放的能量将细胞内UA 产物排出[3-4]。ABCG2 表达受AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）调节，有报道发现，通过AMPK/CREB 信号通路可影响ABCG2 表达，从而缓解2型糖尿病小鼠的HUA[5]。 因此，调节ABCG2/AMPK 通路改善UA 沉积是治疗HUA 的有效途径。

参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》，具有益气健脾、渗湿止泻的功效。 临床运用显示，其能改善HUA 痛风性关节炎[6]，治疗间歇期痛风性关节炎[7]，调节血清白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、C 反应蛋白、UA 及红细胞沉降率，改善关节肿胀及疼痛状况[8]。目前，尚无相关动物实验报道，并且是否能通过AMPK/ABCG2 改善UA 沉积尚不清楚。 本实验通过观察参苓白术散对HUA 小鼠模型血清UA 及肠组织AMPK、ABCG2 蛋白的影响，初步探索参苓白术散降UA 的作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF 级雄性昆明小鼠36 只，体质量18～22 g，购于三峡大学动物实验中心，许可证号：SCXK（鄂）2017-0012。 饲养于湖北中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK（鄂）2017-0067，饲养环境：温度为（22±2） ℃，相对湿度为50%～70%，适应性喂养1周。本实验操作严格遵守动物福利相关规定，由湖北中医药大学动物实验伦理委员会批准，伦理审批号：HUCMS202111013。

1.2 药物与试剂

参苓白术散组成：党参10 g，茯苓10 g，炒白术10 g，山药10 g，炒白扁豆7.5 g，莲子5 g，炒薏苡仁5 g，砂仁5 g，桔梗5 g，甘草10 g。生药均购自湖北中医药大学黄家湖医院，统一煎煮成生药含量为1 g/mL 的汤剂。 非布司他片（杭州朱养心药业有限公司，批号：20210805）。

氧嗪酸钾（合肥博美生物科技有限责任公司，批号：YZLCP0016）；羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：CP300-800）；UA（批号：GM1110）、谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase, ALT，批号：GM1102）、谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST，批号：GM1103）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；CysC ELISA 检测试剂盒（批号：PC215）、RIPA 裂解液（批号：P0013B）、超敏电化学发光显影液（批号：P0018S-2）均购自上海碧云天生物技术有限公司；GAPDH（批号：P0018S-2）、兔多抗磷酸化的AMPK（phosphorylated AMPK, p-AMPK）抗体（批号：bs-3026R）、兔多抗ABCG2 抗体（批号：bs-0662R）均购自北京博奥森生物有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司，批号：G2026-200T）；总RNA 提取试剂盒（批号：TSP413）、逆转录互补DNA 试剂盒（批号：TSK313S）、PCR 试剂盒（批号：TSE202）均购自北京擎科公司。 小鼠AMPK、ABCG2 引物均由武汉赛维尔生物科技有限公司合成。 详见表1。

表1 引物序列

1.3 主要仪器

高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号：KZ-III-F）；冷冻高速离心机（日本日立公司，型号：CR21G）；电转仪（北京六一仪器厂，型号：DYCZ-40）；RT-qPCR 仪（美国ABI 公司，型号：5900）；显微镜（型号：E100）、成像系统（型号：NikonDS-U3）均购自日本尼康公司；全自动生化仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司，型号：Chemray 800）。

2 方法

2.1 动物造模、分组及给药方法

36 只小鼠，随机分成4 组：空白组、模型组、中药组、西药组。空白组除外，其余各组每天腹腔注射氧嗪酸钾悬液0.6 g/kg，连续7 d，血清UA 升高提示造模成功[9]。 造模完成后，根据人给药剂量，1 剂/d（1 剂生药为77.5 g），配制1 g/mL 的参苓白术散悬液。按照小鼠与成人的体表面积换算公式[10]计算，中药组给予参苓白术散5 g/kg 灌胃，西药组给予非布司他0.25 g/kg 灌胃，空白组、模型组均给予生理盐水0.1 mL/kg。 各组均干预14 d。

2.2 取材方法

取材前12 h 禁食不禁水，末次给药1 h 后，2%戊巴比妥钠30 mg/kg 麻醉，心脏采血，室温静置1 h后，3000 r/min、半径13 cm、4 ℃离心10 min，收集上层血清，置于-80 ℃冰箱内冷冻保存。

小鼠安乐死后，快速剥离左叶肝、左侧肾、回肠组织，生理盐水冲洗干净，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分组织，经液氮速冻后，置于-80 ℃低温冰箱内保存。

2.3 生化法检测血清UA

取4 μL 血清，加入250 μL 反应试剂，波长510 nm，上机，全自动生化仪自动测定UA。

2.4 ELISA 法检测血清CysC 含量

取血清，严格按照ELISA 试剂盒步骤操作，每孔50 μL 血清，依次加入标准品、加样加酶、温育、洗涤、显色、每孔加终止液50 μL，终止反应，450 nm波长依序测量各孔的光密度值，根据标准曲线，计算CysC 蛋白浓度。

2.5 HE 染色法检测肾、回肠组织病理变化

取4%多聚甲醛固定液中固定48 h 的肾、回肠组织，梯度乙醇脱水；二甲苯透明；浸蜡包埋；5 μm切片、脱蜡，HE 染色，光学显微镜下观察并采集图片。

2.6 Western blot 检测回肠组织AMPK、p-AMPK、ABCG2 蛋白表达

取50 mg 回肠组织，加入1 mL RIPA 裂解液及PMSF 蛋白酶抑制剂，高速组织研磨仪匀浆后置于冰上反应30 min，10 000 r/min、半径13 cm 离心15 min，取上清液蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，制备蛋白样品。SDS-PAGE 电泳后湿转法转膜，10%脱脂牛奶室温下封闭2 h，TBST 洗膜3 次，加入兔多抗ABCG2、p-AMPK 于4 ℃冰箱内孵育过夜，次日辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，超敏电化学发光液显影。采用Image J 图像处理软件计算出目标蛋白和内参GADPH 对应条带灰度值的比值，统计分析。

2.7 RT-qPCR 检测回肠组织ABCG2 mRNA 表达

取50 mg 回肠组织，加Trizol 1 mL 提取总RNA，超微量分光光度计测定RNA 浓度。 采用第一链互补DNA 合成试剂盒将RNA 转录为互补DNA，反应条件：25 ℃，5 min；52 ℃，15 min；83 ℃，5 min；4 ℃，10 min。 取稀释5 倍的互补DNA 4 μL，加入上、下游引物各0.2 μL，进行RT-qPCR，40 个循环。 绘制扩增曲线熔解曲线，结果采用2－△△Ct计算分析。

2.8 安全性评估

2.8.1 HE 染色观察肝病理变化 取4%多聚甲醛固定液中固定48 h 的肝组织，梯度乙醇脱水；二甲苯透明；浸蜡包埋；5 μm 切片、脱蜡，HE 染色，光学显微镜下观察并采集图片。

2.8.2 生化法检测肝功能 取12 μL 血清，加入240 μL 反应试剂，波长340 nm，上机，全自动生化仪自动测定AST；取12 μL 血清，加入240 μL 反应试剂，波长340 nm，上机，全自动生化仪自动测定ALT。

2.9 统计学方法

图片分析采用Image Pro Plus 5 软件分析，数据采用SPSS 21.0 软件分析。 计数资料以“±s”表示，数据先进行正态及方差齐性检测，若两项皆符合，采用单因素方差（ANOVA）分析；若数据不符合正态分布或者方差不齐，采用非参数检验。 以P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 参苓白术散对血清UA、CysC 的影响

与空白组比较，模型组UA、CysC 含量均显著升高（P＜0.01）。 与模型组比较，西药组和中药组UA 含量显著降低（P＜0.01）；中药组CysC 含量显著降低（P＜0.01）。西药组CysC 含量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 中药组UA、CysC含量与西药组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 详见图1。

图1 参苓白术散对各组小鼠血清UA、Cysc 水平的影响

3.2 参苓白术散对回肠、肾组织病理变化的影响

空白组，肾小球大小均匀，肾小管结构清晰，边界明显，上皮细胞形态正常；模型组，肾间质有炎性细胞浸润，肾小球未见明显萎缩，肾小管结构可见，上皮细胞轻微脱落；中药组及西药组上皮细胞脱落症状有所改善。 详见图2。

图2 参苓白术散对各组小鼠肾组织的影响（HE 染色）

空白组回肠组织黏膜皱襞规则，肠绒毛完整、整齐、密集；模型组肠绒毛存在大量炎细胞团，肠绒毛短小，隐窝深度变浅，肠黏膜上皮细胞出现不同程度损伤；与模型组比较，中药组肠绒毛完整，排列较为稀疏，炎性细胞浸润和肠黏膜上皮细胞损伤有所改善；西药组炎性细胞浸润改善，肠黏膜上皮细胞损伤，微绒毛坏死脱落，未见明显好转。 详见图3。

图3 参苓白术散对各组小鼠回肠组织的影响（HE 染色）

3.3 参苓白术散对回肠组织p-AMPK、ABCG2 蛋白的影响

与空白组比较，模型组p-AMPK、ABCG2 蛋白含量均显著降低(P＜0.01)。 与模型组比较，中药组和西药组p-AMPK、ABCG2 蛋白含量均显著升高(P＜0.01)。 详见图4。

图4 参苓白术散对各组小鼠回肠组织p-AMPK、ABCG2 蛋白的影响

3.4 参苓白术散对回肠组织ABCG2 mRNA 的影响

与空白组比较，模型组ABCG2 mRNA 含量显著降低（P＜0.01)。 与模型组比较，中药组和西药组ABCG2 mRNA 均显著升高（P＜0.01)。 详见图5。

图5 参苓白术散对各组小鼠回肠组织ABCG2 mRNA表达的影响

3.5 参苓白术散药物安全性的评估

3.5.1 对肝功能的影响 各组间血清ALT、AST 比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 详见图6。

图6 参苓白术散对各组小鼠血清AST、ALT 水平

3.5.2 对肝组织病理的影响 肝板的细胞排列紧密，肝小叶结构清晰，从整体来看肝窦无规律性扩张。详见图7。

图7 各组小鼠肝组织病理变化（HE 染色，×40）

4 讨论

随着饮食结构及生活方式的改变，HUA 发病率呈逐年升高趋势[11]。 HUA 和痛风有明确的因果关系，是同一种疾病的不同病理过程[12]。 HUA 可引起急性痛风性关节炎、痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形、UA 性肾病等，严重危害患者健康。

早期HUA 无临床症状，通过血清UA 判定其发病，中医学尚无明确辨证体系。若出现一些列UA 沉积后诱发症状，如关节红肿热痛等，HUA 则归属“痛痹”的范畴。究其病因，为平素多食高粱肥甘厚味，致脾失运化而痰浊内生；明其病机，乃为痰阻气血运行，而致气滞、血瘀；反之，气滞、血瘀，水津不布又可化生痰浊，正如李东垣《脾胃论·脾胃胜衰论》云：“百病皆由脾胃衰而生”。 《素问·至真要大论》云：“诸湿肿满，皆属于脾”，脾虚运化无力，则生湿邪，湿邪随经脉、肌肉、三焦等组织泛溢于四肢百骸，从而表现出关节肿胀、疼痛等不适。 因此，HUA 中医基本病因病机可概括为“肥甘厚味，脾失运化，诸湿肿满”。

参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》，具有益气健脾的功效，由薏苡仁、甘草、桔梗、砂仁、白术、白茯苓、党参、山药组成。 方中党参、白术、茯苓、甘草，为四君子汤，益气健脾；加上山药、炒白扁豆，补土生金，兼有补肺的作用；薏苡仁祛湿，砂仁暖胃，莲子补心，陈皮燥湿，桔梗辛开宣肺，载药上行。该方益气健脾，针对痛痹的主要病机，具有一定疗效[13]。现代药理学研究表明，薏苡仁具有抗氧化、镇痛抗炎药理作用，能舒经除痹，改善关节疼痛[14]；茯苓提取出茯苓多糖及三萜类成分，具有利尿、保肝、镇静、提高免疫力、抗炎、抗肿瘤以及降血脂等多种药理作用[15]，茯苓可通过缓解肾脏损伤及调节肠道菌群来促进机体内UA 的排泄进而达到降UA 的效果[16]。 因此，提示参苓白术散具有改善痛风的物质基础。

UA 是碳、氮、氢和氧的杂环化合物，是存在于血液循环中的嘌呤代谢的氧化产物，体内的UA 水平通过其生成和排泄的平衡来维持，生成、排泄失衡是HUA 发生的根本原因[17]。 本实验结果显示，参苓白术散降低模型小鼠血清UA 沉积，证明参苓白术散具有调节UA 过量沉积的功能，具有防止HUA 的作用。UA 在生理pH 值下以尿酸盐阴离子的形式存在，不能透过细胞膜，需要转运蛋白。ABCG2 是一种在近端肾小管上排泄尿酸盐转运蛋白，其活性决定了细胞内UA 水平，ABCG2 也在肝和肠细胞中表达。 已有实验证实，小鼠肠道ABCG2 的功能障碍或活性丧失会增加尿中UA 的排泄[18]。 本实验结果显示，参苓白术散升高模型小鼠回肠组织ABCG2 表达，降低血清UA。 ABCG2 是利用ATP 水解释放的能量完成UA 转运，AMPK 是促进产生ATP 的分解代谢重要途径[19]。AMPK 激活依赖于苏氨酸172α 环位点的磷酸化，当AMPKA 磷酸化完成，才能发挥其正常功能[20]。 本实验结果显示，参苓白术散影响AMPK的磷酸化，调节ABCG2 蛋白表达。

综上所述，参苓白术散调节HUA 小鼠肠组织AMPKA 磷酸化，升高ABCG2 表达，降低血清UA 含量是治疗HUA 的关键环节。并且本实验通过血清肝功能、肝组织病理评估参苓白术散药物安全性，结果显示参苓白术散对肝功能及肝组织无影响，值得临床推广应用。 本研究不足之处，未能检测AMPK通路其他相关蛋白，进一步明确参苓白术散防治HUA的机制。