我国香菇杂交育种相关技术发展*

2022-12-27胡建平

中国食用菌 2022年10期

胡建平

（1．庆元县食用菌科研中心，浙江庆元 323800；2．食用菌生物科技浙江省工程研究中心，浙江庆元 323800）

食用菌在我国已经成为第五大农作物，其中香菇（Lentinula edodes）产量占第一。香菇栽培发源于浙江庆元，至今已经有800多年历史[1]。同其他农作物的种子一样，菌种的品质是其生产的重要制约因素。香菇的育种技术日趋成熟，目前主要的育种技术包括：人工选择育种、杂交育种、诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种以及分子标记辅助育种。在众多香菇育种方法中，杂交育种是非常重要的育种技术，因其育种目标性较好，是今后一段时间里香菇品种选育的主要手段[2]。杂交育种是一个系统性工程，包括杂交模式的选择、亲本的选择、杂交种鉴定筛选以及交配型鉴定等。通过将香菇杂交育种及香菇技术发展进行综述，为开展香菇杂交育种等工作提供借鉴。

1 香菇杂交育种相关概念及模式

1.1 单核体

香菇菌丝的每个细胞中有2个独立的细胞核，通过2个细胞核的相互作用，完成香菇遗传物质的传递。在杂交前首先要得到细胞中只含一个细胞核的单核菌丝。由孢子萌发而得到的单核体称为孢子单核体，通过原生质体制备而得到的单核体为原生质体单核体。

1.2 交配型

香菇的交配型由A、B两个交配因子控制，香菇属于异宗结合的四极性担子菌，即必需由2个不同交配型的菌丝细胞交配才能生育。一个香菇菌株分别含有2对不相容的交配因子（A1和A2、B1和B2），同时每个交配因子含有许多复等位基因，使得香菇自然群体的交配型非常庞大。只有A、B因子均不同时，单核体才能配对成双核体[3]。

1.3 杂交种

将来自2个亲本的单核体通过不同的技术手段进行配对可得到双核菌株，即具有2个亲本各一半遗传物质的新菌株，即杂交种。形成杂交种的过程也称双核化，异宗结合担子菌包括交互、单向、限制性3类双核化[4]。

1.4 单-单杂交

利用不同的细胞核的单核体进行两两组合配对，当两个单核体交配型符合配对规则时，会形成双核菌株，这个过程即单-单杂交。利用单-单杂交技术取得的成果较为显著，比如香菇新品种L934与L937的选育[5]、Cr系列的选育[6]、抚香一号的选育[7]等。

1.5 双-单杂交

布勒现象是指1931年布勒发现的单核菌株会被双核菌株双核化，即单核体与双核菌丝接触生长时，单核体细胞核会与双核菌丝中的一个细胞核形成新的双核菌株的现象；香菇也具有布勒现象，利用单核菌株双核化进行的杂交育种即双-单杂交[8]。由于“先导核效应”，即当可亲和的单核菌丝与双核菌丝接触生长时，双核菌株中只有其中一个特定的核进入单核体构成新的双核菌株[9]，因此一种双-单杂交配对组合只形成一种核型的杂交种。同时研究表明，先导核的迁移速受B交配因子控制[10]，相同单核体与不同双核菌株杂交形成的杂交种是同质异核体[11]。利用双单杂交，育种家们成功选育出香菇新品种申香8 号[12]、申香 10 号[13]与 JW 系列[14]。

1.6 自交

自交包括多孢自交和单孢自交。多孢自交即同一菌株的孢子制作成合适浓度的孢子悬浮液，涂布于PDA培养皿中，萌发后各菌落生长交织起来后，形成具有拮抗线的多个小块，分别挑取其中一小块，转接培养后，经拮抗等鉴定，得到杂交种，香菇新品种“申香1644”的选育就采用了多孢自交技术[15]。单孢自交则是同一菌株，通过孢子收集、单核体制备后，进行配对组合，经过镜检挑取杂交种的方法。

1.7 多孢杂交

多孢杂交是利用收集到的不同亲本菌株的孢子，制成合适浓度混合的悬液，经过与多孢自交相同的涂布、挑取等工序得到杂交种的过程。

由于多孢杂交、多孢自交不像单孢杂交一样能够明确知道是由哪2个单核体配对组合而成，且关于多孢自交与多孢杂交报道的文献也较少，对于要进一步进行遗传学分析的育种，不建议过多涉及。因此建议利用孢子、原生质体制备等技术首先得到单核体，再进行自交或杂交，更利于后续工作的开展。

2 亲本的筛选

亲本的选择至关重要，关系着杂交育种的效率和最终能否得到目标菌株。因此应根据基因型对杂交后代的性状有较为准确的预判，再根据育种目标筛选亲本[16]。然而以往在选择亲本时，更多的育种人是根据经验与技巧进行筛选，不能较精准的预判育种结果，导致育种效率较为低下。

为此，科研工作者在亲本筛选上进行了一定的研究与探索。可以利用聚类分析法选择香菇杂交亲本[17]，亲本间DNA的相似值作为亲缘关系的判断标准[18]。随机引物扩增多态性DNA（RAPD）标记[19]，简单重复性序列间区（ISSR）标记[20]技术都可用于分析亲本间的亲缘关系等，并据此选择亲本。

育种家认为，亲本来源地与杂交后代栽培地相同时，选育出的子代出菇率更高[21]。另外研究表明，目前我国在用的香菇菌种种质来源比较窄[22-23]，已经成为制约香菇生产的一大因素。因此在香菇育种中要注重收集野生种质资源，经过评价后，能够利用杂交技术将更多的野生香菇基因引入主栽品种体系中。

在亲本筛选方面，虽然已经开展了一些科研工作，但仍然是依据经验者居多。如何构建系统的种质资源评价体系，同时利用先进的表型组学和基因组学技术，为杂交育种选择更合适的亲本，是目前面临的重要挑战，也是关系杂交育种效率和靶向性的问题。

3 单核体及其制备

3.1 孢子单核体

孢子单核体是指由孢子萌发而成的单核体。孢子单核体的制备，首先是得到亲本子实体，收集其弹射出来的孢子，通过制作孢子悬浮液，涂布后，挑取单菌落，经过镜检鉴定最终得到单核体。由于孢子单核体经过了有性生殖过程，孢子中的遗传物质发生过重组等，得到的单核体遗传物质同亲本具有较大差异[24]。

3.2 原生质体单核体

利用溶壁酶溶解亲本的双核菌丝细胞壁制备原生质体，再在恢复培养基中使其恢复细胞壁和生长，在原生质体恢复过程中会形成部分只具有一个细胞核的菌落，挑取并筛选这些单菌落，即得到原生质体单核体，这些单核体由于没有经过有性生殖世代，其遗传性状同亲本保持高度的一致[25]。

4 杂交种鉴定、筛选、种性保持

杂交育种的最终目的是能够在众多交配组合中选到符合育种目标的杂交种，因此还涉及杂交种的鉴定、筛选以及后续的保藏等。

杂交配对组合要求达到一定的数量，才能获得符合预期的杂交种。然而传统的方法是经过显微镜检观察锁状联合挑取杂交种，再经过鉴定、菌丝培养和出菇试验，最终筛选出杂交种，这样的操作工作量大，效率不高且耗时长。

杂交种鉴定可以用拮抗试验进行，但是拮抗反应在遗传关系较近的菌株间分辨率不高，且易受环境及操作者经验等因素的制约[26]，因此拮抗试验只能作为初步判断结果[27]。为提高判断准确性，育种家将拮抗试验与酯酶同工酶酶谱连用进行综合判断[28]。灰色关联度分析也被用于杂交种的筛选中[29-30]，然而此分析方法要求将杂交种进行出菇试验，根据观察与相关结果进行分析，需要投入大量的资源和时间。

研究表明，在分子水平通过杂交种DNA多态分析，聚类分析等手段是可以有效提高杂交育种效率的[29]。RAPD分析因其灵敏度高、可重复性强、易操作而被引入到杂交育种分析中[31]。之后内转录间隔区（ITS）序列分析[32]、ISSR[33]、信使 RNA（mRNA）差异显示技术[34]等相继用于香菇杂交育种中。

对于杂交种筛选出来后如何进行种性保持等方面的研究较少，黄秀治[35]研究了杂交种多孢自交、杂交种组织分离、亲本单核体重新配对、杂交种自交、原始菌株传代等对杂交种种性保持的影响，认为原始菌株传代、杂交种组织分离、杂交种自交可以得到稳定的菌株，同时自交还能提高杂交优势。

5 交配型及其鉴定

交配型的鉴定与研究香菇杂交育种密切相关[36]，只有符合交配规则的交配型单核体组合才能配对形成杂交种。香菇作为异宗结合的四极性担子菌，每个菌株子实体能够至少形成4种交配型[37]，而且在香菇这个群体中，不同菌株有着许多的交配因子复等位基因，据估算香菇群体中存在121个A因子和151个B因子[38]。

香菇交配型基因有许多应用：1）遗传研究，估测自然群体中香菇的不亲合因子数；2）种质资源评价与种质库建设；3）菌种鉴定，以原生质体单核体的交配型作为标准，采用交配型分子标记进行菌种鉴定[36，39]；4）菌种退化指标，以交配型基因的复等位性和多态性为依据，以待测菌株的原生质体单核体为材料，香菇单核体交配型的异常，可以作为菌种退化的一个遗传指标[40]。

在杂交配对组合之前，最好将亲本单核体按照交配型进行分类，从而提高杂交组合配对成功率。交配型的检测方法主要有两两配对法、标准菌株法及分子标记法。两两配对法对于A、B因子均相同和均不同的配对组合，通过观察锁状联合结构可以可靠地进行判断；而对于A相同而B不同的配对组合和B相同而A不同的组合，则需要通过培养基转换法（OWE-SOJ）加以鉴定[41]。分子标记法是基于基因序列分析进行交配型鉴定，可以基于单核苷酸多态性SNP分型[37]、ISSR分型等。

交配型因子存在着偏分离的现象，即一个菌株的孢子交配型并不趋于1∶1∶1∶1，引起偏分离的原因有很多，可能是致死纯合基因[42]、亲本来源[43]、亲本细胞质遗传影响[44]、杂交过程中重组与突变[45]等。同样双核菌株制备的原生质体单核体交配型比例通常也不是趋于1∶1。该比例与核的再生能力和生长速度有关[46-47]，偏分离的主要影响因子是B因子，它控制着核的存活率[45]。研究表明，栽培菌株交配型偏分离大于野生菌株[48]。

6 杂交技术

在杂交技术上，较为传统与常见的是先检测单核体极性，再进行配对组合；另外一种则是采用单核体菌落形态观察，来选择配对组合[35]。规范化的杂交操作有利于提高杂交育种效率以及后续的遗传分析，但目前关于杂交工艺的研究与阐述较少，因此建议对杂交工艺进行研究，形成规范化的标准，便于今后杂交育种工作的开展与交流。

7 展望

杂交育种是现行和今后一段时间内香菇育种的主要方式，为提高杂交育种的效率和目标性，应该从以下几个方面加以深入研究。

7.1 单核菌丝保存技术

单核体在保藏过程中遗传性状较容易发生改变，研究发现经过1年保存后，单核体间生长差异等变小[49]。单核体能否长期保存将制约杂交育种，开发适宜长期保藏单核体的技术，如单核体超低温液氮保存等，已迫在眉睫。同时还可以研究将单核体双核化，在使用时能快速得到该单核体的技术。

7.2 分子标记快速精准育种

现有的利用DNA多态性开发的分子标记技术，依据于某个群体的多态性，仅适用于该群体的区分与鉴定。通过分子标记等技术的开发与利用，精准育种已取得一定成效，但是由于遗传学基础研究较为滞后，所开发的分子标记大部分不是通用的，而仅仅可作为一个群体（比如几个或者几十个菌株间）分离鉴定的依据。靶向测序基因型检测（GBTS）等有望较好的弥补以往分子标记不通用的问题。同时可以结合基因测序等现代技术，定位更多基因，通过基因编辑技术，创制更多的优良育种材料，再利用杂交育种，提高育种效率和目的性。