锌指蛋白488基因对肝细胞癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响△

黄凯达，范鑫，郑志高，李雯雯，林雨标

厦门市海沧医院肿瘤科，福建 厦门 361026

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统中常见的恶性肿瘤之一。中国恶性肿瘤流行病学数据显示，肝癌发病率居全部恶性肿瘤第四位，病死率居全部恶性肿瘤第二位[1]。肿瘤复发、侵袭和转移是导致HCC患者预后不良的重要因素。深入了解肿瘤复发、侵袭和转移的分子机制对于改善HCC患者预后具有重要意义。磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）是与肿瘤发生发展密切相关的信号通路，该信号通路通过多种生长因子与受体结合而被激活，介导肿瘤细胞的增殖、迁移以及自我更新等过程，进而影响肿瘤细胞的生长和转移，与HCC的发生发展密切相关[2]。阻断PI3K/AKT信号通路可以阻断细胞周期进程，促进肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞的上皮-间充质转化以及肿瘤新生血管生成，进而抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[3-4]。锌指蛋白（zinc finger protein，ZNF）是最大的序列特异性DNA结合蛋白家族，通过调节下游基因的转录在恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用[5]。ZNF通过PI3K/AKT信号通路促进恶性肿瘤细胞生长和转移，有望成为治疗恶性肿瘤的靶点[6]。ZNF488是一种Krüppel样锌指转录因子，已被证实为致癌基因，可通过调控PI3K/AKT信号通路调节胰腺癌细胞的生物学行为[7]，但其在HCC中的功能及作用机制目前尚不清楚。本研究探讨ZNF488对HCC细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响，期望能为HCC的靶向治疗提供新的思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院细胞库。DNA提取试剂盒、pLL3.7-ZNF488 shRNA载体质粒及PI3K、AKT、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗体试剂盒、DH5α感受态细胞均购自上海信裕生物科技有限公司，Lipofectamin 3000、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DMEM细胞培养基均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，CCK8试剂盒、细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均购自武汉普诺赛生命科技有限公司，限制性内切酶BbsⅠ和SacⅠ均购自美国NEB公司，Matrigel基质胶购自美国Corning公司。酶标仪购自迈瑞公司，显微镜购自美国FEI公司，流式细胞仪购自德国Partec公司，蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 ZNF488稳定敲除细胞系的构建

利用麻省理工学院的规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）在线设计工具（http://crispr.mit.edu/）设计出靶向ZNF488的20 bp的靶向序列小向导RNA（small guide RNA，sgRNA），合成后的2条单链DNA退火形成双链DNA，pLL3.7-ZNF488 shRNA载体经BbsⅠ酶切后与双链引物连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选出若干阳性克隆，测序验证后选取正确序列的质粒进行大提。利用Lipofectamin 3000试剂将构建好的质粒转染到HepG2细胞中，挑选若干绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）阳性的细胞进行单克隆培养，提取基因组后扩增出相应靶基因序列，测序分析并对碱基缺失结果进行比对分析，选取基因缺失正确的细胞克隆，筛选出稳定敲除ZNF488的HepG2细胞（pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组）。同时，将转染pLL3.7-ZNF488 shRNA空载质粒的HepG2细胞（pLL3.7-ZNF488 shRNA组）和正常的HepG2细胞（HepG2组）作为对照。

1.3 CCK8法检测细胞增殖能力

收集各组细胞，2000/孔接种于96孔板中，加入等量的DMEM完全培养液，培养0、24、48、72 h后，每 100 μl培养液中加入 10 μl CCK8 试剂，置于37℃培养箱中孵育2 h，采用酶标仪检测各孔在450 nm处的光密度（optical density，OD）值。上述步骤重复3次。以时间为横坐标、OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况及细胞周期

转染前16～24 h，以3×104/孔将细胞接种于6孔板中，转染后48 h收集细胞；采用含0.5%血清的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗2次；采用预冷的2%～4%多聚甲醛（pH=7.4）在-20℃条件下固定15 min，再在70%乙醇中固定过夜；离心去除上清后，用含0.5%血清的PBS冲洗2次，细胞重悬于RNase A缓冲液（50 μg/ml）中，37 ℃避光消化 30 min；加入 400 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）（100 μg/ml），室温染色 30 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况及细胞周期各时相的分布情况。上述步骤重复3次。

1.5 Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力

将Matrigel胶和无血清培养基混匀放入Transwell小室，对基底膜进行包被。3组细胞离心后用无血清的培养液重悬细胞后计数，置入Transwell小室中，放入培养箱中进行培养。24 h后，擦除多余的液体Matrigel胶，采用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下观察结晶紫染色细胞数即为侵袭细胞数目。上述步骤重复3次。迁移实验：除了不对Transwell小室基底膜进行包被外，其余步骤同侵袭实验。

1.6 蛋白质印迹法（Western blot）检测ZNF488蛋白及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况

将HepG2组、pLL3.7-ZNF488 shRNA组、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组细胞裂解、变性，提取细胞总蛋白。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法检测蛋白浓度，蛋白样品中加入上样缓冲液，沸水浴变性5 min后，加至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中，凝胶电泳后将分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封闭并进行抗体孵育，采用电化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显色试剂盒进行显色。采用Quantity One图像分析软件对Western blot实验结果进行分析。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，计算p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K蛋白相对表达量，目的蛋白相对表达量=目的条带灰度值/GAPDH条带灰度值。每个蛋白样品设3个重复。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用Dunnettt检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别HepG2细胞中ZNF488蛋白相对表达量的比较

HepG2组、pLL3.7-ZNF488 shRNA组、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组HepG2细胞中ZNF488蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组 HepG2细胞中ZNF488蛋白相对表达量低于HepG2组和pLL3.7-ZNF488 shRNA组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同组别HepG2细胞中ZNF488蛋白相对表达量的比较（±s）

表1 不同组别HepG2细胞中ZNF488蛋白相对表达量的比较（±s）

注：*与pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组比较，P＜0.05

组别HepG2组pLL3.7-ZNF488 shRNA组pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组F值P值0.98±0.11*0.97±0.15*0.13±0.01 57.744 0.01 ZNF488蛋白表达

2.2 不同组别HepG2细胞增殖情况的比较

培养24 h，HepG2组、pLL3.7-ZNF488 shRNA组、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组HepG2细胞OD值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；培养48、72 h，HepG2组、pLL3.7-ZNF488 shRNA 组、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组HepG2细胞OD值比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养48、72 h，pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组HepG2细胞OD值均低于HepG2组和pLL3.7-ZNF488 shRNA组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同时间不同组别HepG2细胞OD值的比较（±s）

表2 不同时间不同组别HepG2细胞OD值的比较（±s）

注：*与同时间pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组比较，P＜0.05

组别HepG2组pLL3.7-ZNF488 shRNA组pLL3.7-ZNF488 shRNAZNF488组F值P值0.26±0.15 0.25±0.12 0.21±0.08 0.145 0.868 0.63±0.16*0.56±0.11*0.24±0.08 8.823 0.016 0.83±0.18*0.75±0.16*0.32±0.12 9.352 0.014 24 h 48 h 72 h

2.3 不同组别HepG2细胞凋亡情况和细胞周期的比较

HepG2组、pLL3.7-ZNF488 shRNA组、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组HepG2细胞凋亡率、G2期细胞所占百分比比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组细胞凋亡率、G2期细胞所占百分比均高于HepG2组和pLL3.7-ZNF488 shRNA组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 不同组别HepG2细胞凋亡情况和细胞周期的比较（%，±s）

表3 不同组别HepG2细胞凋亡情况和细胞周期的比较（%，±s）

注：*与pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组比较，P＜0.05

组别 凋亡率G2期细胞所占百分比?

2.4 不同组别HepG2细胞侵袭和迁移情况的比较

HepG2组、pLL3.7-ZNF488 shRNA组、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组HepG2细胞侵袭细胞数目、迁移细胞数目比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组 HepG2细胞侵袭细胞数目、迁移细胞数目均低于HepG2组和pLL3.7-ZNF488 shRNA组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表4）

表4 不同组别HepG2细胞侵袭和迁移情况的比较（±s）

表4 不同组别HepG2细胞侵袭和迁移情况的比较（±s）

注：*与pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组比较，P＜0.05

组别HepG2组pLL3.7-ZNF488 shRNA组pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组F值P值46.21±3.63*43.57±3.79*15.23±1.52 88.935＜0.01 68.52±6.72*53.28±5.96*19.61±2.76 63.843＜0.01侵袭细胞数目 迁移细胞数目

2.5 不同组别HepG2细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白相对表达量的比较

HepG2组、pLL3.7-ZNF488 shRNA组、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组HepG2细胞中p-AKT、p-PI3K蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；HepG2组、pLL3.7-ZNF488 shRNA组、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组HepG2细胞中AKT、PI3K相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组HepG2细胞中p-AKT、p-PI3K蛋白相对表达量均低于HepG2组和pLL3.7-ZNF488 shRNA组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表5）

表5 不同组别HepG2细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白相对表达量的比较（±s）

表5 不同组别HepG2细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白相对表达量的比较（±s）

注：*与pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488组比较，P＜0.05

组别HepG2组pLL3.7-ZNF488 shRNA组pLL3.7-ZNF488 sh-RNA-ZNF488组F值P值p-AKT 1.00±0.13 0.97±0.15 0.23±0.078*38.648＜0.01 AKT 0.97±0.12 0.99±0.13 0.93±0.11 0.194 0.829 p-PI3K 0.98±0.09 0.96±0.15 0.30±0.06*39.404＜0.01 PI3K 0.99±0.18 0.97±0.11 0.95±0.12 0.061 0.941

3 讨论

肝癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，手术、射频消融治疗和化疗均能有效杀灭肿瘤细胞，但治疗后转移和复发的比例非常高，常导致患者治疗效果不佳及预后不良。恶性肿瘤侵袭转移过程与细胞外基质降解、细胞骨架变化、肿瘤细胞黏附和运动、上皮-间充质转化、转录因子激活、间充质基因的表达及血管生成等有关。分子靶向治疗作用于HCC发生发展过程中涉及的特异性分子及其调控的信号转导通路，在抑制肿瘤细胞增殖、延缓复发转移以及改善患者预后等方面具有一定的优势，正逐渐成为HCC治疗的重要手段。开发有效的肝癌生物标志物和治疗靶点对肝癌治疗具有重要意义。

PI3K/AKT是许多信号分子的下游信号转导通路，在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的过程中发挥重要作用，近年来，在许多种恶性肿瘤细胞中发现了PI3K/AKT信号转导通路的过度激活。研究表明，PI3K/AKT信号通路异常活化与肿瘤生长、增殖、凋亡、血管生成、侵袭及转移有关，并因此影响患者的预后[8]。PI3K/AKT信号通路通过与上下游靶点的协同作用调控肿瘤多重耐药，影响细胞对化疗药物的敏感性[9-10]。PI3K/AKT信号通路在肝癌的发生发展过程中扮演着重要角色。王开琼等[11]研究显示，微小RNA（microRNA，miRNA）-182过表达可能通过激活PI3K/AKT信号通路调控基质金属蛋白酶9、c-Myc和血管内皮生长因子的表达，从而促进HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭。罗彩云等[12]研究显示，沉默脂肪细胞增强子结合蛋白2可通过影响PI3K/AKT信号通路抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导HCC细胞凋亡。Liao等[13]研究显示，阿帕替尼可能通过阻断PI3K/AKT信号通路影响HCC细胞的放射敏感性。

ZNF可通过不同的功能性结构域、反式调控原件招募不同的染色体修饰因子及相互作用蛋白，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育、促进或抑制肿瘤的发生发展等方面具有重要作用[14]。ZNF在HCC组织和细胞中均存在异常表达，与HCC的发生、发展、侵袭、转移、凋亡和肿瘤复发等相关。He等[15]研究显示，ZNF384通过特异性靶向细胞周期蛋白（cyclin）D1的启动子区域并上调cyclin D1的表达来促进HCC细胞增殖，可能成为HCC的潜在治疗靶点。Yi等[16]研究显示，ZNF689在HCC组织中高表达，其阳性表达与肿瘤直径、微血管侵犯、肿瘤包膜浸润及不良预后显著相关。

ZNF488基因位于染色体10q11.22，其编码的蛋白分子量为38 kD，由340个氨基酸组成，是一种少突胶质细胞特异性转录抑制因子。ZNF488扮演着癌基因的角色，可通过激活AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号通路促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，从而诱导胰腺癌细胞发生上皮-间充质转化[17]。ZNF488表达与鼻咽癌患者的总生存期、局部区域无复发生存期、无远处转移生存期和无进展生存期相关，其机制为ZNF488通过影响胶原蛋白Ⅳ/黏附斑激酶/AKT信号通路增强细胞黏附，从而上调cyclin D1的表达，促进细胞周期进程，并通过不依赖胱天蛋白酶（caspase）的方式抑制细胞凋亡[18]。本研究采用CRISPR基因编辑技术构建了稳定的ZNF488基因敲除HepG2细胞，流式细胞仪检测结果显示，ZNF488基因敲除的HepG2细胞在生长过程中阻滞在G2期的细胞比例增多，ZNF488基因敲除可阻滞HepG2细胞周期进展，同时促进细胞凋亡。CCK8法和Transwell小室实验检测结果显示，敲除ZNF488可以抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭。PI3K/AKT信号通路可调控细胞周期，增加相关蛋白的表达会改变细胞周期分布。进一步研究发现，敲除ZNF488基因后，p-AKT、p-PI3K蛋白相对表达量均下降，表明敲除ZNF488基因可能阻断PI3K/AKT信号通路，降低HepG2细胞的增殖能力，诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖、迁移和侵袭。敲除ZNF488对HCC的影响有可能是通过调控PI3K/AKT信号通路实现的，但其具体调控机制还有待进一步深入研究。

综上所述，本研究应用CRISPR基因编辑技术构建了稳定的ZNF488基因敲除HepG2细胞，发现抑制ZNF488的表达可抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡，其机制可能与阻断PI3K/AKT信号通路有关，为HCC的靶向治疗提供了新的靶点，同时也有助于评估靶向治疗的效果。