miR-30a-5p 表达对结直肠癌发生及转移的影响研究

彭柳花，贾雄，贺德，陈天明

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是临床消化道常见恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、早期转移侵袭能力较强和患者预后5 年生存率较低等特点。既往研究数据显示［1］，我国CRC 发病率约15%，死亡率约10%。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是CRC 肿瘤细胞发生侵袭、转移的始动因素，是导致CRC 患者病情进展的重要因素［2］。微小RNA（microRNA，miR）被证实在肿瘤的恶性进展中发挥广泛生物学功能［3-4］。miR-30a-5p在肺癌、脑胶质瘤、肾细胞癌等恶性肿瘤中表达降低。而miR-30a-5p 表达的异常是否与CRC 的病情进展有关，尤其是miR-30a-5p 是否能通过调控CRC患者EMT 过程从而促进病情进展仍需进一步研究［5］。基于此背景，本研究拟通过离体实验和在体实验，以期明确miR-30a-5p 表达与CRC 病情发展的关系及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和细胞系 采用NCM460、HCT116 细胞系和裸鼠作为研究对象。本研究经南方科技大学医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂与仪器 倒置荧光显微镜（深圳市众寻光学仪器有限公司），细胞培养箱（济南好来宝医疗器材有限公司），Chemi Doe XRS+成像仪（上海土森视觉科技有限公司），涡旋振荡器（河北慧采科技有限公司），流式细胞仪（南京珺蔚生物科技有限公司），SP 试剂盒（上海研启生物科技有限公司），H202（夏津尚达经贸有限公司），柠檬酸盐缓冲溶液（武汉卡诺斯科技有限公司），DAB 溶液（广州鼎国生物技术有限公司），苏木精碧（上海如吉生物科技发展有限公司），Trizol（北京华越洋生物科技有限公司），逆转录试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），RIPA 裂解液（上海邦景实业有限公司），胎牛血清（上海沪震实业），高糖培养基（广州济恒医药科技），双抗（北京博奥派克生物科技），Lipofectamine 2000（上海北诺生物科技有限公司），MTT细胞增殖（北京百奥创新科技有限公司），细胞毒性检测试剂盒（上海歌凡生物科技有限公司），Transwell 小室（南京迅贝生物科技有限公司），培养基（山东萍聚生物科技有限公司），双抗霉素（湖北猫尔沃生物医药有限公司），胰酶（郑州裕和食品添加剂有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 选取NCM460、HCT116 细胞系作为研究对象。将细胞置于常规培养基（DEME 培养基、1640 培养基）中进行培养，并在培养基中补充10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 mg/L 链霉素。当细胞融合度＞80%时进行消化、传代操作，并取对数期细胞进行后续实验。

1.2.2 qRT-PCR 检测 采用Trizol 法提取上述培养完成细胞的总RNA，逆转录得到cDNA，随后严格按照试剂盒说明进行操作。反应条件：90 ℃预变性6 min；95 ℃变性15 s，64 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，重复42 个 循 环。引 入 序 列：（forward）CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC；（reverse） CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC。

1.2.3 细胞转染 取对数期的HCT116 细胞，每组3 个平行样本，接种至6 孔板（1×105个/ml），并进行培养。实验分组为对照组、miR-30a-5p 模拟物组和miR-30a-5p 抑制剂组。严格按照LipofactamineTM2000 试剂盒说明书转染miR-30a-5p 模拟物、miR-30a-5p 抑制剂，对照组不做任何处理。转染操作完成后继续进行培养，48 h 后进行后续实验。

1.2.4 miR-30a-5p mRNA 表达水平检测 采用同

1.2.2 中的方法及引物设计，检测NCM460、HCT116细胞系中miR-30a-5p mRNA 表达水平。

1.2.5 HCT116 细胞Transwell 实验观察侵袭能力 取Transwell 杯状小室，首先将Matrigel 胶进行稀释，稀释操作完毕均匀涂抹至杯底，于下室滴入含10%胎牛血清的培养基，于上室中滴入各组10%细胞悬液200 μl。培养24 h 直至Matrigel 胶降解。培养完成后将小室取出并进行冲洗（PBS）和染色，染色操作完毕采用无菌棉签将上层细胞擦去，进行细胞计数观察。

1.2.6 HCT116 细胞划痕试验观察迁移能力 取上述实验中培育至48 h 的细胞。重悬后接种至6 孔板，待细胞融合后将培养基弃去，并采用20 μl 移液器枪头在培养板底部进行划痕操作，并重新加入培养基后再次培养过夜，次日显微镜拍照后计算细胞迁徙率。

1.2.7 Western blotting 法检测HCT116 细胞Ecadherin、Vimentin 表达量 取上述实验中培育至48 h 的HCT116 细胞，提取全蛋白并进行定量，定量操作严格按照试剂盒说明进行。取适量样本进行凝胶电泳，操作完成后进行洗涤，滴入E-cadherin、Vimentin 的一抗（1∶1 500），4 ℃条件下孵育过夜，次日滴入二抗（1∶2 000），再次在室温下孵育2 h，孵育完成后再次进行洗涤。洗涤操作完成后加入发光液，并进行显影、成像等操作。所有实验操作均进行3 次，取平均值。

1.2.8 裸鼠成瘤实验 按miR-30a-5p 模拟物、miR-30a-5p 抑制剂、对照组的分组方式进行裸鼠成瘤实验，每组8 只。在实验前所有裸鼠均于同样条件下进行饲养，时间1 周。将转染完成细胞采用1 000 r/min进行离心（离心半径16 cm），时间为5 min，随后采用PBS 进行冲洗，冲洗完毕收集细胞。采用皮下注射的方式将1×106个转染完成的HCT116 细胞注射至裸鼠腹腔内。随后每日观察裸鼠肿瘤的大小，计算生长40 d 后的肿瘤体积。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行数据统计。正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NCM460、HCT116 细胞系miR-30a-5p mRNA表达水平比较

在HCT116 细胞中miR-30a-5p mRNA 表达量（0.29 ± 0.02）较在NCM466 细胞中表达量（0.76 ±0.12）明显更低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组侵袭能力比较

与对照组比较，miR-30a-5p 模拟物组细胞侵袭能力明显更弱，而miR-30a-5p 抑制剂组细胞侵袭能力明显更强，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组侵袭能力比较（± s，每组n=3）

表1 各组侵袭能力比较（± s，每组n=3）

注：与对照组比较aP＜0.05

组别miR-30a-5p 模拟物组miR-30a-5p 抑制剂组对照组F 值P 值每个视野进入细胞数量62.57±6.32a 187.67±17.65a 130.57±12.67 21.37＜0.05

2.3 各组迁移能力比较

与对照组比较，miR-30a-5p 模拟物组细胞迁移能力明显更弱，而miR-144-3p 抑制剂组细胞迁移能力明显更强，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组迁移能力比较（± s，每组n=3）

表2 各组迁移能力比较（± s，每组n=3）

注：与对照组比较aP＜0.05

组别miR-30a-5p 模拟物组miR-30a-5p 抑制剂组对照组F 值P 值每个外溢穿膜细胞数量45.23±6.70a 93.23±6.70a 75.21±8.33 15.62＜0.05

2.4 各组E-cadherin、Vimentin 蛋白表达水平比较

与对照组比较，miR-30a-5p 模拟物组Vimentin明显更低，E-cadherin 明显更高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；miR-30a-5p 抑制剂组Vimentin 明显更高，E-cadherin 明显更低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组E-cadherin、Vimentin 蛋白表达水平比较（± s，每组n=3）

表3 各组E-cadherin、Vimentin 蛋白表达水平比较（± s，每组n=3）

注：与对照组比较aP＜0.05

组别miR-30a-5p 模拟物组miR-30a-5p 抑制剂组对照组F 值P 值E-cadherin 1.78±0.67a 0.42±0.17a 1.08±0.08 6.17＜0.05 Vimentin 0.54±0.03a 2.03±0.67a 1.06±0.12 5.85＜0.05

2.5 40 d 时裸鼠肿瘤体积比较

与对照组比较，miR-30a-5p 模拟物组肿瘤体积明显更小，miR-30a-5p 抑制剂组肿瘤体积明显更大，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 40 d 时裸鼠瘤体体积比较（mm3，± s）

表4 40 d 时裸鼠瘤体体积比较（mm3，± s）

注：与对照组比较aP＜0.05

组别miR-30a-5p 模拟物组miR-30a-5p 抑制剂组对照组F 值P 值肿瘤体积637.57±61.57a 1 489.54±123.54a 987.67±68.78 11.21＜0.05例数8 8 8

3 讨论

CRC 是起源于上皮组织的消化道恶性肿瘤，糖尿病史、家族史、高血压史、高脂饮食和低纤维饮食是导致CRC 发生的危险因素［6］。近年来，随着微创切除术治疗方法的逐年规范化和术后联合放化疗综合疗法的推行，CRC 患者预后5 年生存率得到显著提升［7］。然而CRC 具有易侵袭、转移的特征，而起病初期又较隐匿，使得部分患者就诊时已错过手术治疗最佳时期。远处转移是影响CRC 患者预后生存期的独立危险因素，既往研究数据显示［8-10］，15%～25% 患者存在肝转移。故进一步探讨CRC患者转移的分子病理特征，在早期进行筛查并针对高风险人群进行靶向干预的意义重大。

miR-30a-5p 是miR-30 家族成员，其定位于人类6 号染色体的q13 位置。国内外大量研究发现，在前列腺癌、喉鳞状细胞癌等恶性肿瘤中miR-30a-5p 的表达下调［11-12］。邱会等［13］研究发现，miR-30a-5p 的表达对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的增殖及迁移存在靶向调控作用。何雨等［14］研究发现，miR-30a-5p 可通过调节胰腺导管腺癌患者成纤维细胞活化，从而影响肿瘤的增殖、迁移过程。王勇等［11］研究发现，前列腺癌患者miR-30a-5p 的表达改变与肿瘤细胞的增殖、侵袭行为密切相关。此外有研究发现，miR-30a-5p 可通过影响肿瘤细胞的EMT 过程，从而影响肿瘤细胞的侵袭和迁移［15-16］。EMT 主要指细胞外基质与肿瘤基底膜被破坏、细胞间丧失黏附和细胞极性变化，使肿瘤细胞迁移和侵袭能力被显著增强［17］。E-cadherin 的表达降低和Vimentin的表达显著上升是反应EMT 过程的重要参考［18］。本研究结果显示，HCT116 细胞中miR-30a-5p 的表达明显更低，提示miR-30a-5p 的表达改变可能与CRC 患者基础病理发展有关。为进一步验证miR-30a-5p 在CRC 中发挥的作用，本研究通过转染miR-30a-5p 模拟物和miR-30a-5p 抑制剂，结果显示，miR-30a-5p 模拟物组HCT116 的侵袭和迁移能力明显低于miR-30a-5p 抑制剂组，表明miR-30a-5p的表达改变与CRC 侵袭、迁移行为有关。为进一步明确miR-30a-5p 的作用机制，采用Western bloting法检测Vimentin 和E-cadherin 的表达水平，结果显示，较miR-30a-5p 抑制剂组，miR-30a-5p 模拟物组Vimentin 明显更低，而E-cadherin 明显更高，表明miR-30a-5p 可通过调控CRC 细胞的EMT 行为影响病情进展。本研究采用裸鼠进行在体实验发现，细胞注射完成40 d 后，miR-30a-5p 抑制剂组肿瘤体积显著高于miR-30a-5p 模拟物组，证实miR-30a-5p的表达改变与CRC 的发生密切相关，亦明确临床可通过监测结直肠癌患者miR-30a-5p 的表达情况，对其病情发展作出预测并为临床的早期靶向干预提供新线索［19］。

综上所述，miR-30a-5p 可通过调控CRC 患者EMT 过程，从而影响肿瘤病情的发生、发展。然而本研究尚存不足，未纳入临床CRC 前瞻性队列作为研究对象，故在今后研究中仍需进一步开展实验予以论证。